用于表达G蛋白偶联受体或其亚基的构建体及其用途制造技术

本发明专利技术的目的在于提供用于表达G蛋白偶联受体的构建体及其利用。本发明专利技术的构建体是用于表达G蛋白偶联受体蛋白或其亚基的构建体，其特征在于在单一载体中从5’侧起依次包含：编码G蛋白α亚基蛋白的核酸、包含IRES序列的核酸、以及编码G蛋白偶联受体蛋白或其亚基的核酸。

Construction and application for expression of G protein coupled receptor or its subunits

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】用于表达G蛋白偶联受体或其亚基的构建体及其用途
本专利技术涉及用于表达G蛋白偶联受体或其亚基的构建体、导入了本专利技术的构建体的转化细胞、使用了本专利技术的转化细胞的物质的生理反应的测定方法、用于测定物质的生理反应的本专利技术的转化细胞的用途、包含本专利技术的转化细胞且用于物质的生理反应的测定方法的试剂盒。
技术介绍
1.G蛋白偶联受体及G蛋白介导的信号转导G蛋白偶联受体是在真核生物的细胞质膜上或细胞内部的组成膜上存在的受体的形式的1种。感受来自细胞外(膜外)的各种信号(神经递质、激素、化学物质、光等)时，G蛋白偶联受体发生结构变化，激活与膜内侧结合的三聚体G蛋白，进行信号转导。G蛋白是结合于细胞膜的内表面、且Gβγ二聚体牢固地结合于Gα亚基的异源三聚体。配体结合于G蛋白偶联受体而被激活时，结合于G蛋白偶联受体的G蛋白使其具有的GDP从Gα亚基分离，与新的GTP分子结合(GDP型→GTP型的转换)。通过该转换，Gα亚基、Gβγ二聚体及G蛋白偶联受体分别分离。分离后的Gα亚基激活其下游的效应器蛋白。G蛋白偶联受体及其下游的G蛋白控制了嗅觉、味觉、视觉、神经传递、代谢、细胞分化及细胞增殖、炎症反应及免疫应答等细胞内信号网络中的大量基本生理化学反应。2.关于味觉及嗅觉的知识味觉是在物质进入口中时，特别是通过存在于舌表面的特异性受体与物质结合而产生的感觉。哺乳动物类的味觉由5种基本味、即咸味、酸味、甜味、鲜味、苦味构成，可以认为是由这些基本味综合而形成。目前认为，咸味、酸味是通过在舌表面的味蕾中存在的味细胞附近侧的细胞膜上表达的若干离子通道型受体而感知的。对于甜味、鲜味、苦味，可以认为是通过由味细胞中存在的G蛋白偶联受体和与其偶联的G蛋白介导的信号转导而感知的。具体而言，已知苦味可以通过命名为T2R家族的分子(苦味受体)(人类为25种)感受，甜味可以通过T1R2+T1R3的异源二聚体(甜味受体)感受，鲜味可以通过T1R1+T1R3的异源二聚体(鲜味受体)感受。对于味觉信息的传递机制的机理，通常理解如下。即，首先，味觉物质与味细胞的受体结合时，经过细胞内的第二信使(IP3、DAG)等介导的信息传递过程使细胞内的钙浓度上升。接着，供给至细胞内的钙离子使神经递质释放至突触，在神经细胞中产生动作电位，其结果是，以受体为起点的味觉信号从味觉神经传递至脑，识别、判断味觉信息，这是通常的说法。嗅觉受体也与苦味受体、甜味受体、鲜味受体等味觉受体同样是G蛋白偶联受体。嗅觉受体存在于嗅上皮的嗅细胞上。嗅细胞是人体中神经细胞与外界直接接触的唯一部位，其另一端与脑中被称为嗅球的区域直接连接。“气味物质”是分子量30～300左右的低分子化合物，据说地球上存在数十万种气味物质。人类有400种以上的嗅觉受体已被鉴定。气味物质结合于嗅觉受体时，与苦味受体、甜味受体、鲜味受体等味觉受体同样地经过细胞内的第二信使等介导的信息传递过程而使细胞内的钙浓度上升。3.G蛋白偶联受体激动剂的评价食品、饮料等中包含的化学物质、神经递质、激素等与G蛋白偶联受体结合而使其发生结构变化，有可能成为激活结合于膜内侧的G蛋白的一系列信号转导的G蛋白偶联受体激动剂。希望简便且效率良好地进行这些G蛋白偶联受体激动剂的候选物质的生理反应评价。只要能够适当地进行蛋白质偶联受体激动剂的候选物质的生理反应评价，就可以实现饮料食品、医药品等的味道、品质等的改善、蛋白质偶联受体激动剂的用量的调节等有益的效果。另一方面，对于上述食品、饮料等中包含的物质，也可以进行基于感官试验的评价。然而，已知基于感官试验的评价伴随以下的实质性问题：不容易保证评价的客观性，评价所花费的人工、时间、费用的负担很大，无法在短时间对大量物质进行评价等。因此，作为替代感官试验的评价方法，报告了如下方法：制备表达G蛋白偶联受体及Gα蛋白的细胞系，向这样的细胞系直接添加G蛋白偶联受体激动剂(候选化合物)来对效果进行评价。在用于G蛋白偶联受体激动剂的评价的细胞系中，需要在同一细胞中表达G蛋白偶联受体蛋白和Gα蛋白。为了使这2种蛋白表达，通常广泛使用了将包含编码各蛋白质的核酸的2种载体同时或依次进行基因导入的共基因导入法。这些例如为以下的方式。(a)用包含编码Gα蛋白的核酸的载体、和包含编码G蛋白偶联受体蛋白或其亚基的核酸的载体对宿主细胞进行共转染；(b)用包含编码G蛋白偶联受体蛋白或其亚基的核酸的载体对稳定表达Gα蛋白的细胞株进行转化。作为使用了共基因导入法的例子，例如，对于苦味受体，记载于Chem.Senses35,p.157-170,2010；TheJournalofNeuroscience,23(19),p.7376-7380,2003；BiochemBiophysResCommun,365(4):p.851-855,2008。另外，对于甜味受体，记载于日本特开2008-13570号公报、日本特开2008-228690号公报、WO2007-121604号公报。然而，在任何情况下均无法获得制备难度高(成功率低)、稳定的数据。因此，不能认为是具有足以用于进行G蛋白偶联受体激动剂的评价的品质的细胞系。作为表达2种蛋白质的方法，除了共基因导入法以外，还已知使用将表达2种蛋白质的各核酸插入1个载体而成的共表达载体的方法。通常，即使将表达2种蛋白质的2种核酸串联地直接插入单一的载体，越是位于远离启动子的位置的核酸，越难以被翻译，蛋白质的表达量越低。因此，越是位于远离启动子的位置的核酸，越需要想办法提高翻译效率。日本专利5905187记载了“一种甜味受体表达构建体，其是将编码味觉受体的味觉受体亚基T1R2及T1R3、以及G蛋白α亚基的各基因插入同一质粒而成的，所述甜味受体表达构建体在位于EF-1α启动子的下游、且在紧邻编码甜味受体亚基T1R2的基因之后，通过IRES序列连接编码G蛋白α亚基的基因，进一步在位于其下游存在CMV启动子的下游、且在紧邻编码甜味受体亚基T1R3的基因之后，通过IRES序列连接编码G蛋白α亚基的基因”。日本专利5905187的构建体从5’侧起依次具有EF-1α启动子-T1R2-IRES-Gα-CMV启动子-TIR3-IRES-Gα这样的特定结构。在该构建体中，T1R2及T1R3配置于各特定的启动子的下游、以及IRES的上游。IRES是能够进行非帽依赖性翻译的翻译起始来进一步提高蛋白质合成的效率的RNA因子。已知，通常与受到帽依赖性翻译的上游蛋白相比，IRES介导的翻译具有低效率的倾向。在本专利技术之前，尚未得到具有足以用于进行G蛋白偶联受体激动剂的评价的品质的细胞系。现有技术文献专利文献专利文献1：日本特开2008-13570号公报专利文献2：日本特开2008-228690号公报专利文献3：WO2007-121604号公报非专利文献非专利文献1：Chem.Senses35,p.157-170,2010非专利文献2：TheJourn本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种构建体，其用于表达G蛋白偶联受体蛋白或其亚基，所述构建体在单一载体中从5’侧起依次包含：编码G蛋白α亚基蛋白的核酸、包含IRES序列的核酸、以及编码G蛋白偶联受体蛋白或其亚基的核酸。/n

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】20171023 JP 2017-2046871.一种构建体，其用于表达G蛋白偶联受体蛋白或其亚基，所述构建体在单一载体中从5’侧起依次包含：编码G蛋白α亚基蛋白的核酸、包含IRES序列的核酸、以及编码G蛋白偶联受体蛋白或其亚基的核酸。


2.根据权利要求1所述的构建体，其中，G蛋白偶联受体或其亚基是视紫红质样受体类型或代谢性谷氨酸受体/代谢性信息素受体类型的G蛋白偶联受体。


3.根据权利要求1所述的构建体，其中，G蛋白偶联受体是视紫红质样受体类型的G蛋白偶联受体。


4.根据权利要求1所述的构建体，其中，G蛋白偶联受体为苦味受体。


5.根据权利要求1～4中任一项所述的构建体，其中，载体为质粒载体。


6.根据权利要求1～4中任一项所述的构建体，其中，载体为包含CMV启动子的质粒载体。


7.根据权利要求1～4中任一项所述的构建体，其中，载体为包含CMV启动子及潮霉素抗性基因的质粒载体。


8.根据权利要求1～4中任一项所述的构建体，其中，载体为包含EF1α启动子的质粒载体。


9.根据权利要求1～4中任一项所述的构建体，其中，载体为包含EF1α启动子及嘌呤霉素抗性基因的质粒载体。


10.根据权利要求1～9中任一项所述的构建体，其中，IRES序列为2型的IRES序列。


11.根据权利要求1～10中任一项所述的构建体，其中，IRES序列为来自脑心肌炎病毒的IRES序列。


12.根据权利要求1～7中任一项所述的构建体，其中，在编码G蛋白偶联受体蛋白或其亚基的核酸的5’侧包含编码具有提高G蛋白偶联受体蛋白或其亚基...

【专利技术属性】
技术研发人员：下村一平，山本岳，上泷将史，飞田直哉，
申请(专利权)人：日本烟草产业株式会社，
类型：发明
国别省市：日本;JP