哺乳动物细胞表达载体及其构建方法与应用技术

本发明专利技术提供一种哺乳动物表达载体，采用SV40核心启动子作为筛选基因的启动子，结合筛选基因密码子非最优化并以核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示的富含A/T的序列代替筛选基因起始密码子前Kozak序列的设计，改变筛选基因的翻译、转录水平，确保载体上的筛选基因的低水平表达，从而在该载体整合至宿主细胞的基因组之后，只有整合在适合外源基因高表达的位置的细胞株才能存活，不仅能够有效降低筛选细胞的数量，并且能够提高所筛选得到细胞株的表达能力。

Mammalian cell expression vector and its construction and Application

【技术实现步骤摘要】
哺乳动物细胞表达载体及其构建方法与应用
本专利技术属于基因工程领域，特别涉及一种哺乳动物细胞表达载体及其构建方法与应用。
技术介绍
蛋白质在合成过程中要经过翻译后的加工和修饰，才能成为有活性的蛋白质，其中，翻译后加工过程包括：磷酸化、糖基化、二硫键形成、酰基化和蛋白酶加工等。原核细胞不具备翻译后加工的能力，因此，原核细胞在表达真核生物蛋白时效果。酵母，植物，昆虫细胞虽然能对重组蛋白进行糖基化修饰，但其糖基化方式与哺乳动物细胞不同，有可能产生免疫原性。因此，开发以哺乳动物细胞、尤其是中国仓鼠卵巢细胞(CHO细胞)为宿主，获得高水平生产性细胞株的载体成为本领域的当务之急。其中，采用CHO细胞表达既能保证重组蛋白质的正确糖基化和磷酸化，又能保证重组蛋白二硫键的正确配对和蛋白质的正确折叠，从而使由CHO细胞表达的重组蛋白与天然蛋白质具有相似的理化性质和生物学功能。但是在一般情况下，外源基因在CHO细胞中的表达量很低，很难用于实际工业化生产，而且需要大量筛选细胞株，获得高产细胞株的效率较低。因此，有必要构建一种可使外源基因在哺乳动物细胞中获得高效本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种哺乳动物细胞表达载体，其特征在于，所述哺乳动物细胞表达载体包括有：筛选基因表达框和目的基因表达框；/n所述筛选基因表达框包括筛选基因启动子和筛选基因序列；/n所述筛选基因启动子为SV40核心启动子；所述筛选基因序列的5’端连接有核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示的富含A/T的序列，且不含有Kozak序列。/n

【技术特征摘要】
1.一种哺乳动物细胞表达载体，其特征在于，所述哺乳动物细胞表达载体包括有：筛选基因表达框和目的基因表达框；
所述筛选基因表达框包括筛选基因启动子和筛选基因序列；
所述筛选基因启动子为SV40核心启动子；所述筛选基因序列的5’端连接有核苷酸序列如SEQIDNO.2所示的富含A/T的序列，且不含有Kozak序列。


2.根据权利要求1所述的哺乳动物细胞表达载体，其特征在于，所述SV40核心启动子的核苷酸序列如SEQIDNO.1所示。


3.根据权利要求1所述的哺乳动物细胞表达载体，其特征在于，所述筛选基因为zeocin抗性基因、G418抗性基因、嘌呤霉素抗性基因或潮霉素抗性基因；和/或所述筛选基因的序列采用在真核细胞中非最优化的密码子。


4.根据权利要求3所述的哺乳动物细胞表达载体，其特征在于，所述筛选基因的核苷酸序列如SEQIDNO.4所示。


5.根据权利要求1～4任一项所述的哺乳动物细胞表达载体，其特征在于，所述筛选基因表达框的核苷酸序列如SEQIDNO.3所示。


6.根据权利要求1～4任一项所述的哺乳动物细胞表达载体，其特征在于，所述哺乳动物细胞表达载体的骨架部分取自真核表达载体pMCS。


7.一种哺乳动物细胞表达载体的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)构建筛选基因表达框：所述筛选基因启动子为SV40核心启动子；所述筛选基因序列的5’端连接有核苷酸序列如SEQIDNO.2所...

【专利技术属性】
技术研发人员：张桂涛，李志坤，王勇刚，兰万军，龙婷，林如新，陈静山，
申请(专利权)人：东莞太力生物工程有限公司，
类型：发明
国别省市：广东;44