过表达hACE2基因的巨噬细胞制剂的制备方法技术

本发明专利技术属于分子生物学技术领域，具体涉及一种过表达hACE2基因的巨噬细胞制剂的制备方法。巨噬细胞分离与激活，构建hACE2过表达载体，电转将hACE2过表达载体转进巨噬细胞，采用带有hACE2抗体的磁珠筛选表达hACE2的细胞，即得过表达hACE2基因的巨噬细胞制剂。本发明专利技术首先确定了能够实现特异性、高效识别新冠状病毒和SARS病毒靶位点的人hACE2基因序列，而后通过质粒电转染的方法导入巨噬细胞，利用免疫磁珠筛选hACE2阳性细胞群及测序鉴定，获得过表达hACE2基因的巨噬细胞。本发明专利技术过表达hACE2基因的巨噬细胞制剂的生产，大大提升了巨噬细胞消除以hACE2为受体的病毒能力。

Preparation method of macrophage preparation with overexpression of ACE2 gene

【技术实现步骤摘要】
过表达hACE2基因的巨噬细胞制剂的制备方法
本专利技术属于分子生物学
，具体涉及一种过表达hACE2基因的巨噬细胞制剂的制备方法。
技术介绍
肾素-血管紧张素系统(renninangiotensinsystem,RAS)在机体中发挥有重要的生物学作用，它可以通过对心血管、肾脏的调节而维持血压、体液和电解质的平衡。血管紧张素II(angiotensinII,AngII)在RAS系统中发挥着重要的病理生理学作用，八肽的AngII是由血管紧张素转化酶(angiotensinconvertingenzyme,ACE)将十肽的AngI水解2个羧基而产生。2000年Tipnis等发现了在RAS系统中发挥有重要生物学作用的血管紧张素转换酶2(ACE2)，ACE2与ACE的不同在于它是一种单羧基肽酶，可以水解AngII生成Ang(1-7)，Ang(1-7)具有其高度亲和力的Mas受体，Ang(1-7)与ACE2和Mas受体共同构成ACE2-Ang(1-7)-Mas轴，成为RAS系统里的另一重要的生物学作用途径，其中多项研究表明该途径可以对抗ACE-An本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种过表达hACE2基因的巨噬细胞制剂的制备方法，其特征在于包括如下步骤：/n(1)巨噬细胞分离与激活/n巨噬细胞分离，培养，激活，繁殖，收集；/n(2)构建hACE2过表达载体/n①引物设计和合成：根据hACE2 mRNA序列设计引物；/n②总RNA的提取：收集A549细胞，提取总RNA；/n③采用RT-PCR扩增hACE2基因；/n④将hACE2基因与pEGFP-N1质粒片段连接得到hACE2过表达载体pEGFP-N1-hACE2；/n(3)电转将hACE2过表达载体转进巨噬细胞/n巨噬细胞中加入电转液和hACE2过表达载体进行电转，电转结束后，继续培养，收集细胞；/n(4)采用带有h...

【技术特征摘要】
1.一种过表达hACE2基因的巨噬细胞制剂的制备方法，其特征在于包括如下步骤：
(1)巨噬细胞分离与激活
巨噬细胞分离，培养，激活，繁殖，收集；
(2)构建hACE2过表达载体
①引物设计和合成：根据hACE2mRNA序列设计引物；
②总RNA的提取：收集A549细胞，提取总RNA；
③采用RT-PCR扩增hACE2基因；
④将hACE2基因与pEGFP-N1质粒片段连接得到hACE2过表达载体pEGFP-N1-hACE2；
(3)电转将hACE2过表达载体转进巨噬细胞
巨噬细胞中加入电转液和hACE2过表达载体进行电转，电转结束后，继续培养，收集细胞；
(4)采用带有hACE2抗体的磁珠筛选表达hACE2的细胞
电转结束后收集的细胞采用带有hACE2抗体的磁珠筛选进行分离，分离所得hACE2阳性巨噬细胞扩大培养，即得过表达hACE2基因的巨噬细胞制剂。


2.根据权利要求1所述的过表达hACE2基因的巨噬细胞制剂的制备方法，其特征在于步骤(2)中所述的引物如下：
ACE2F：5’-catgaagcctatgtcaagctcttcctggctcc-3’
ACE2R：5’-catggaattcctaaaaggaggtctgaacatc-3’。


3.根据权利要求1所述的过表达hACE2基因的巨噬细胞制剂的制备方法，其特征在于步骤(3)中所述的电转液组成如下，以体积百分比计：
无钙镁PBS90％
无血清培养基RPMI164010％；
以无钙镁PBS...

【专利技术属性】
技术研发人员：王清路，许晓松，程旭，
申请(专利权)人：王清路，许晓松，
类型：发明
国别省市：山东;37