PD-1免疫检查点解除抑制的T淋巴细胞制剂的制法制造技术

本发明专利技术属于分子生物学技术领域，具体涉及一种PD‑1免疫检查点解除抑制的T淋巴细胞制剂的制法。单碱基基因编辑PD‑1转染体系构建，T淋巴细胞分离与激活，共转染T淋巴细胞，流式细胞仪筛选与测序分析、鉴定。本发明专利技术实现将人PD‑1的ITSM区基因序列的关键酪氨酸位点密码子突变，导致基因转录、翻译后的PD‑1蛋白的免疫检查功能解除。本发明专利技术制备的PD‑1免疫检查点解除抑制活性T淋巴细胞制剂提升了T淋巴细胞杀灭肿瘤细胞的能力且极大程度的保留了PD‑1的生物活性及其他功能，并能增强长期肿瘤免疫效果。

Preparation of T-lymphocyte preparations for release of inhibition by immune checkpoint PD-1

【技术实现步骤摘要】
PD-1免疫检查点解除抑制的T淋巴细胞制剂的制法
本专利技术属于分子生物学
，具体涉及一种PD-1免疫检查点解除抑制的T淋巴细胞制剂的制法。
技术介绍
PD-1(ProgrammedDeath1，程序性死亡受体-1)是一种重要的免疫抑制分子。由PD-1及其配体PD-L1、PD-L2组成的通路，在维持外周免疫耐受中起着至关重要的作用。肿瘤和引起慢性感染的病原体能利用该途径从T细胞介导的肿瘤特异性和病原体特异性免疫中逃逸，主要是通过它的表面产生PD-L1，当PD-L1联接到一类免疫细胞T细胞的PD-1蛋白上即引起T细胞失活，T细胞就不能发现肿瘤向免疫系统发出攻击肿瘤的信号。PD-1–PD-L1共抑制通路被用于肿瘤治疗开发并取得显著效果，在多项临床试验中对于各种类型癌症的缓解率达20％～50％。PD-1由单个N-末端免疫球蛋白可变区(IgV)样结构域、将IgV结构域与质膜分开并包含大约20个氨基酸的茎区、跨膜区和包含基于酪氨酸信号基序的胞质尾区构成(见图1)。当免疫受体酪氨酸抑制基序(ITIM)酪氨酸改变为苯丙氨酸(Y223F)时，PD-1抑制作用得以保留；但当免疫受体酪氨酸转换基序(ITSM)改变时(Y248F)，这些抑制作用则会丧失。基因组编辑(简称为基因编辑)技术是利用人工核酸酶对基因组进行靶向修饰的遗传工程技术，是当今生命科学领域的研究热点。目前，几乎所有的CAR-T疗法公司都和基因编辑公司开展合作，包括诺华、Juno和Cellectis在内的6家CAR-T疗法企业与IntelliaTherapeutics、EditasMedicine和CRISPRTherapeutics等基因编辑公司强强联合，开发结合基因编辑技术特别是CRISPR技术的CAR-T疗法。CRISPR/Cas9基因编辑系统简便、高效，但其定点修饰依赖于效率低下的同源重组机制，因此精准编辑基因的能力有待提高。单碱基编辑技术(baseeditor，BE)可以不切断DNA和RNA序列，直接对碱基进行编辑，其编辑效率均达到50％以上，远超CRISPR，且几乎无不良副作用。单碱基编辑技术为基因编辑技术的研究和应用增添了一种重要的工具。现有技术中用于肿瘤治疗的T淋巴细胞制剂副作用大，制备过程复杂、周期长。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种PD-1免疫检查点解除抑制的T淋巴细胞制剂的制法，简化了细胞制剂的生产程序，提升了制剂获得的速度，制得的T淋巴细胞制剂副作用低。本专利技术所述的PD-1免疫检查点解除抑制的T淋巴细胞制剂的制法，包括以下步骤：(1)单碱基基因编辑PD-1转染体系构建根据人PD-1的ITSM区基因序列设计gRNAtarget序列，然后将gRNAtarget序列克隆进表达载体，获得gRNAtarget表达载体质粒；gRNAtarget序列为5’-GTGGCATACTCCGTCTGCTC-3’或5’-TGGCATACTCCGTCTGCTCA-3’；gRNAtarget表达载体质粒和无剪切DNA基因编辑质粒混合后得到单碱基基因编辑PD-1转染体系；(2)T淋巴细胞分离与激活T淋巴细胞分离，培养，激活，繁殖，收集；(3)共转染T淋巴细胞T淋巴细胞中加入电转液和步骤(1)得到的单碱基基因编辑PD-1转染体系进行共转染，转染结束后，继续培养，收集细胞；(4)流式细胞仪筛选与测序分析、鉴定转染结束后收集的细胞采用流式细胞仪进行分离，分离所得单克隆细胞扩大培养，提取基因组进行测序分析、鉴定，继续扩大培养，即得PD-1免疫检查点解除抑制的T淋巴细胞制剂。步骤(1)中gRNAtarget序列优选为5’-GTGGCATACTCCGTCTGCTC-3’。步骤(1)中表达载体为pHBLV-U6-gRNA-EF1-ZsGreen表达载体。步骤(1)中无剪切DNA基因编辑质粒为xCas9(3.7)-ABE(7.10)，xCas9(3.7)-ABE(7.10)是汉恒生物科技(上海)有限公司提供。xCas9(3.7)-ABE(7.10)表达TadA和nCas9基因及linker和NLS核定位信号，可用于程序化无剪切DNA单碱基编辑ITSM的酪氨酸中A∶T碱基对转换成G∶C碱基对的腺嘌呤。步骤(1)中gRNAtarget表达载体质粒和无剪切DNA基因编辑质粒的摩尔比为1:1。步骤(3)中电转液组成如下，以体积百分比计：无钙镁PBS90％无血清培养基RPMI164010％；以无钙镁PBS和无血清培养基RPMI1640的总体积为100％计，EDTA加入量为30g/L，蔗糖加入量为200mmol/L。步骤(3)中电转液的制备方法是将无钙镁PBS与无血清培养基RPMI1640混合，然后加入EDTA和蔗糖，溶解后再过滤除菌。步骤(3)中继续培养时间为48h。步骤(4)中流式细胞仪筛选方法是细胞转染48h后，用PBS清洗细胞两次，经流式细胞仪筛选GFP阳性T淋巴细胞，即获得gRNA高表达的群体免疫细胞制剂。本专利技术所述的PD-1免疫检查点解除抑制的T淋巴细胞制剂的制法，包括以下具体步骤：(1)单碱基基因编辑PD-1转染体系构建根据人PD-1的ITSM区基因序列设计gRNAtarget序列两条：5’-GTGGCATACTCCGTCTGCTC-3’和5’-TGGCATACTCCGTCTGCTCA-3’，选择其中一条gRNAtarget序列克隆进表达载体，获得gRNAtarget表达载体质粒；根据CRISPR-DO网站对两条gRNA序列进行评分，gRNAtarget序列5’-GTGGCATACTCCGTCTGCTC-3’的分值最高，所以优选gRNAtarget序列5’-GTGGCATACTCCGTCTGCTC-3’克隆进表达载体；gRNAtarget表达载体质粒和无剪切DNA基因编辑质粒混合后得到单碱基基因编辑PD-1转染体系；(2)T淋巴细胞分离与激活T淋巴细胞分离，培养，激活，繁殖，收集；(3)共转染T淋巴细胞T淋巴细胞中加入电转液和步骤(1)得到的单碱基基因编辑PD-1转染体系(即两个质粒：gRNAtarget表达载体质粒和无剪切DNA基因编辑质粒)进行共转染，转染结束后，继续培养，收集细胞；(4)流式细胞仪筛选与测序分析、鉴定转染结束后收集的细胞采用流式细胞仪进行分离带有绿色荧光蛋白的单克隆细胞，将分离所得单克隆细胞分别扩大培养后，提取基因组进行测序分析、鉴定，符合需求的细胞继续扩大培养，即得PD-1免疫检查点解除抑制的T淋巴细胞制剂。本专利技术构建特异的、高效的PD-1基因免疫受体酪氨酸抑制基序ITSM中酪氨酸的单碱基基因编辑PD-1转染体系可用于肿瘤治疗与预防的免疫细胞制剂生产。单碱基基因编辑PD-1转染体系经电转染T淋巴细胞后，利用流式细胞仪筛选GFP阳性细胞及测序鉴定后筛选的PD-1免疫检查点解除抑制的T淋巴细胞可用于人体回输预防或治疗肿瘤。本专利技术利用生物信息学技术获得特异性、高效识别靶位点的gRNAtarget序列，而后通过汉恒生物科技(上海)有限公司将序列克隆进pHBLV-U6-gRNA-EF1-ZsGreen表达载体，构建成功可以表达带有target序列gRNA的表达载体。本专利技术在构建gRNA表达载体与xCas9(3.7)-ABE(7.10)的基础上，利用本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种PD‑1免疫检查点解除抑制的T淋巴细胞制剂的制法，其特征在于包括以下步骤：(1)单碱基基因编辑PD‑1转染体系构建根据人PD‑1的ITSM区基因序列设计gRNA target序列，然后将gRNA target序列克隆进表达载体，获得gRNA target表达载体质粒；gRNA target序列为5’‑GTGGCATACTCCGTCTGCTC‑3’或5’‑TGGCATACTCCGTCTGCTCA‑3’；gRNA target表达载体质粒和无剪切DNA基因编辑质粒混合后得到单碱基基因编辑PD‑1转染体系；(2)T淋巴细胞分离与激活T淋巴细胞分离，培养，激活，繁殖，收集；(3)共转染T淋巴细胞T淋巴细胞中加入电转液和步骤(1)得到的单碱基基因编辑PD‑1转染体系进行共转染，转染结束后，继续培养，收集细胞；(4)流式细胞仪筛选与测序分析、鉴定转染结束后收集的细胞采用流式细胞仪进行分离，分离所得单克隆细胞扩大培养，提取基因组进行测序分析、鉴定，继续扩大培养，即得PD‑1免疫检查点解除抑制的T淋巴细胞制剂。

【技术特征摘要】
1.一种PD-1免疫检查点解除抑制的T淋巴细胞制剂的制法，其特征在于包括以下步骤：(1)单碱基基因编辑PD-1转染体系构建根据人PD-1的ITSM区基因序列设计gRNAtarget序列，然后将gRNAtarget序列克隆进表达载体，获得gRNAtarget表达载体质粒；gRNAtarget序列为5’-GTGGCATACTCCGTCTGCTC-3’或5’-TGGCATACTCCGTCTGCTCA-3’；gRNAtarget表达载体质粒和无剪切DNA基因编辑质粒混合后得到单碱基基因编辑PD-1转染体系；(2)T淋巴细胞分离与激活T淋巴细胞分离，培养，激活，繁殖，收集；(3)共转染T淋巴细胞T淋巴细胞中加入电转液和步骤(1)得到的单碱基基因编辑PD-1转染体系进行共转染，转染结束后，继续培养，收集细胞；(4)流式细胞仪筛选与测序分析、鉴定转染结束后收集的细胞采用流式细胞仪进行分离，分离所得单克隆细胞扩大培养，提取基因组进行测序分析、鉴定，继续扩大培养，即得PD-1免疫检查点解除抑制的T淋巴细胞制剂。2.根据权利要求1所述的PD-1免疫检查点解除抑制的T淋巴细胞制剂的制法，其特征在于步骤(1)中gRNAtarget序列为5’-GTGGCATACTCCGTCTGCTC-3’。3.根据权利要求1所述的...

【专利技术属性】
技术研发人员：王清路，
申请(专利权)人：王清路，许晓松，
类型：发明
国别省市：山东,37