PD-1基因缺陷型PD-1-CART细胞制剂的制法制造技术

本发明专利技术属于分子生物学技术领域，具体涉及一种PD‑1基因缺陷型PD‑1‑CART细胞制剂的制法。PD‑1‑CAR嵌合序列构建，PD‑1‑CAR慢病毒构建，PD‑1基因缺陷型PD‑1‑CART细胞的构建。本发明专利技术首先通过突变PD‑1蛋白的ITSM基序而后获得具有PD‑L1靶向识别功能的T细胞胞外蛋白部分及跨膜信号引导区，而后通过构建慢病毒质粒获得带有新型CAR结构的慢病毒，转染PD‑1基因缺陷型的T淋巴细胞，即得。本发明专利技术提升了T淋巴细胞靶向杀灭肿瘤细胞的能力且降低了副作用，并能增强长期肿瘤免疫，并为类似新型CAR基因结构的开发提供了参考。

Preparation of pd-1-cart cell preparation with PD-1 gene defect

【技术实现步骤摘要】
PD-1基因缺陷型PD-1-CART细胞制剂的制法
本专利技术属于分子生物学
，具体涉及一种PD-1基因缺陷型PD-1-CART细胞制剂的制法。
技术介绍
PD-1(ProgrammedDeath1，程序性死亡受体-1)是一种重要的免疫抑制分子。由PD-1及其配体PD-L1、PD-L2组成的通路，在维持外周免疫耐受中起着至关重要的作用。肿瘤和引起慢性感染的病原体能利用该途径从T细胞介导的肿瘤特异性和病原体特异性免疫中逃逸，主要是通过它的表面产生PD-L1，当PD-L1联接到一类免疫细胞T细胞的PD-1蛋白上即引起T细胞失活，T细胞就不能发现肿瘤向免疫系统发出攻击肿瘤的信号。PD-1由单个N-末端免疫球蛋白可变区(IgV)样结构域、将IgV结构域与质膜分开并包含大约20个氨基酸的茎区、跨膜区和包含基于酪氨酸信号基序的胞质尾区构成。当免疫受体酪氨酸抑制基序(ITIM)酪氨酸改变为苯丙氨酸(Y223F)时，PD-1抑制作用得以保留；但当免疫受体酪氨酸转换基序(ITSM)改变时(Y248F)，这些抑制作用则会丧失。目前，治疗肿瘤细胞的制剂靶向性不强、副反应大。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种PD-1基因缺陷型PD-1-CART细胞制剂的制法，制得的细胞制剂增强了对肿瘤细胞的靶向性，解除了免疫抑制，降低了相对于传统CART细胞来说的副反应。本专利技术所述的PD-1基因缺陷型PD-1-CART细胞制剂的制法，包括以下步骤：(1)PD-1-CAR嵌合序列构建>人工合成PD-1-CAR嵌合序列，并在全序列5’端ATG前添加EcoRI位点，3’端TGA终止密码子后添加Spel位点，然后克隆进pMD18-T载体，得到pMD18-T-CAR载体；PD-1-CAR嵌合序列为SEQIDNO.1；(2)PD-1-CAR慢病毒构建基于pMD18-T-CAR载体构建pSin-EF2-Pur-CAR载体，然后将pSin-EF2-Pur-CAR、psPAX2和pMD2.G质粒混匀后转染293T细胞，制备PD-1-CAR慢病毒；(3)PD-1基因缺陷型PD-1-CART细胞的构建将PD-1-CAR慢病毒转染PD-1基因缺陷型T淋巴细胞，转染结束后收集的细胞采用流式细胞仪进行分离，分离所得单克隆细胞扩大培养，提取基因组进行测序分析、鉴定，继续扩大培养，即得PD-1基因缺陷型PD-1-CART细胞制剂。步骤(2)中所述的pSin-EF2-Pur-CAR载体的制备方法是采用EcoRI和Spel双酶切pMD18-T-CAR和pSin-EF2-Sox2-Pur两个质粒，回收PD-1-CAR序列和线性化的pSin-EF2-Sox2-Pur，连接构建pSin-EF2-Pur-CAR载体。步骤(2)中所述的pSin-EF2-Pur-CAR、psPAX2和pMD2.G的质量比为15-25：12-18：5-8。步骤(2)中所述的pSin-EF2-Pur-CAR、psPAX2和pMD2.G的质量比优选为20：15：6。步骤(2)中所述的转染时间为45-50h。步骤(2)中所述的转染时间优选为48h。本专利技术所述的PD-1基因缺陷型PD-1-CART细胞制剂的制法，具体包括以下步骤：(1)PD-1基因缺陷型T淋巴细胞的获得按照专利ZL201710649967.6制备。(2)ITSM基序突变的PD-1+4-1BB+CD3ζ序列(CAR序列)合成将设计好的序列送上海生工生物工程公司合成，并在全序列5’端ATG前添加EcoRI位点，3’端TGA终止密码子后添加Spel位点，然后克隆进pMD18-T载体，命名为pMD18-T-CAR。(3)pSin-EF2-Pur-CAR载体构建采用EcoRI和Spel双酶切pMD18-T-CAR和pSin-EF2-Sox2-Pur两个质粒，回收CAR序列部分和线性化的pSin-EF2-Sox2-Pur，链接构建pSin-EF2-Pur-CAR载体。(4)慢病毒的包装将pSin-EF2-Pur-CAR、psPAX2和pMD2.G质粒共转染293T细胞，然后回收带有ITSM基序突变PD-1的CAR基因的慢病毒。(5)转染T细胞将步骤(1)中的T细胞接种到6孔板中，然后将沉淀收集的慢病毒加入6孔板的PD-1基因缺陷型T细胞中；转染结束后收集的细胞采用流式细胞仪进行分离，分离所得单克隆细胞扩大培养，提取基因组进行PCR(引物：F5’-GATGGTTCTTAGACTCCCCAGAC-3’；R5’-GTCTCTTGTCCAAAACATCGTACTC-3’)然后测序分析、鉴定，符合需求的细胞继续扩大培养，即得PD-1基因缺陷型的PD-1-CART淋巴细胞制剂。本专利技术构建特异的、高效的PD-1免疫检查缺陷且具有靶向PD-L1蛋白的PD-1-CART淋巴细胞可用于肿瘤治疗与预防的免疫细胞制剂生产。携带PD-1+4-1BB+CD3ζ结构CAR基因的慢病毒转染PD-1基因缺陷型T淋巴细胞后，利用流式细胞仪筛选GFP或PD-1阳性细胞的T淋巴细胞可用于人体回输预防或治疗肿瘤。本专利技术利用生物信息学技术分析PD-1蛋白的结构与特点，从而设计出PD-1-CAR的慢病毒构建载体，获得的慢病毒可用于T细胞、造血干细胞生产具有PD-L1靶向的细胞。本专利技术使T细胞具有更强攻击、杀灭肿瘤细胞的能力。本专利技术的T细胞实现了免疫检查点的抑制，同时利用天然的PD-1和PD-L1相互识别结合机制从而实现该类T细胞对肿瘤细胞的靶向性，此天然识别机制其结合力度最佳，不过强也不太弱，从而可以有效降低传统CART细胞带来的副作用，PD-1引导结合信号跨膜后，会激活4-1BB与CD3ζ元件，实现激活T细胞。本专利技术根据人PD-1的ITSM基序基因序列密码子特点，将原酪氨酸密码子TAT用密码子TTT代替，设计ITSM基序中酪氨酸突变为苯丙氨酸的PD-1编码序列；细胞的靶向识别及信号传导由ITSM基序突变的PD-1蛋白完成。本专利技术采用ITSM基序(Y248F)突变的PD-1作为CAR的胞外部分和膜内传导区，该设计保留了PD-1对PD-L1或PD-L2的识别作用，而又使其PD-1/PD-L1/2等的信号通路的免疫检查点抑制缺失。本专利技术的新型T细胞采用PD-1基因敲除解除了T细胞对肿瘤细胞的免疫检查点抑制，采用ITSM中酪氨酸突变的PD-1实现了对表达PD-L1或PD-L2肿瘤细胞的靶向攻击，PD-1与PD-L1/2的结合力在机体内适度，可以有效降低传统CART治疗中产生的副反应(细胞因子风暴)，保留全部PD-1序列(仅突变ITSM基序)也就保留了PD-1蛋白在T细胞内的大部分功能。PD-1肽段后嵌合的4-1BB(214-255aa)和CD3ζ(52-163aa)肽段在T细胞起到正性调节。本专利技术的有益效果如下：本专利技术首先通过突变PD-1蛋白的ITS本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种PD-1基因缺陷型PD-1-CART细胞制剂的制法，其特征在于包括以下步骤：/n(1)PD-1-CAR嵌合序列构建/n人工合成PD-1-CAR嵌合序列，并在全序列5’端ATG前添加EcoRI位点，3’端TGA终止密码子后添加Spel位点，然后克隆进pMD18-T载体，得到pMD18-T-CAR载体；/nPD-1-CAR嵌合序列为SEQ ID NO.1；/n(2)PD-1-CAR慢病毒构建/n基于pMD18-T-CAR载体构建pSin-EF2-Pur-CAR载体，然后将pSin-EF2-Pur-CAR、psPAX2和pMD2.G质粒混匀后转染293T细胞，制备PD-1-CAR慢病毒；/n(3)PD-1基因缺陷型PD-1-CART细胞的构建/n将PD-1-CAR慢病毒转染PD-1基因缺陷型T淋巴细胞，转染结束后收集的细胞采用流式细胞仪进行分离，分离所得单克隆细胞扩大培养，提取基因组进行测序分析、鉴定，继续扩大培养，即得PD-1基因缺陷型PD-1-CART细胞制剂。/n

【技术特征摘要】
1.一种PD-1基因缺陷型PD-1-CART细胞制剂的制法，其特征在于包括以下步骤：
(1)PD-1-CAR嵌合序列构建
人工合成PD-1-CAR嵌合序列，并在全序列5’端ATG前添加EcoRI位点，3’端TGA终止密码子后添加Spel位点，然后克隆进pMD18-T载体，得到pMD18-T-CAR载体；
PD-1-CAR嵌合序列为SEQIDNO.1；
(2)PD-1-CAR慢病毒构建
基于pMD18-T-CAR载体构建pSin-EF2-Pur-CAR载体，然后将pSin-EF2-Pur-CAR、psPAX2和pMD2.G质粒混匀后转染293T细胞，制备PD-1-CAR慢病毒；
(3)PD-1基因缺陷型PD-1-CART细胞的构建
将PD-1-CAR慢病毒转染PD-1基因缺陷型T淋巴细胞，转染结束后收集的细胞采用流式细胞仪进行分离，分离所得单克隆细胞扩大培养，提取基因组进行测序分析、鉴定，继续扩大培养，即得PD-1基因缺陷型PD-1-CART细胞制剂。


2.根据权利要求1所述的PD-1基因缺陷型PD-1-CART细胞制剂的制法，其特征在于步骤...

【专利技术属性】
技术研发人员：王清路，
申请(专利权)人：王清路，许晓松，
类型：发明
国别省市：山东;37