一种基因编辑系统及基因编辑的方法技术方案

一种CRISPR/Cas系统，包含指导RNA和Cas蛋白；其中指导RNA由下述两部分组成：该指导RNA能分别与真核细胞B2M基因中具有SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4的靶序列中的两个序列结合。该系统显示出较高的B2M的单基因敲除率。进一步涉及使用该体系对T细胞进行基因编辑的方法，该方法提供了一种高效、安全、简单的生产通用型T细胞的工艺。

A gene editing system and method

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】一种基因编辑系统及基因编辑的方法
本专利技术涉及一种基因编辑系统及基因编辑的方法，尤其是一种CRISPR-Cas系统，以及一种使用该体系对T细胞进行基因编辑的方法。
技术介绍
近来自体免疫细胞回输(又名过继性免疫疗法)在治疗慢性感染或癌症时逐渐被证明具有强劲疗效。以T细胞为基础的过继性免疫疗法通常会利用肿瘤抗原特异性T细胞(例如肿瘤浸润淋巴细胞，TIL)、经过基因改造表达人工受体(例如嵌合抗原受体，CAR)或自然受体(T细胞受体，TCR)的T细胞来指导T细胞攻击癌症细胞(Johnson et al.Cell Research 2017.27:38-58)。CAR分子是由单链抗体可变片段(scFv)、合适的信号传导域和共刺激域组成的。当肿瘤细胞的抗原被CAR分子的scFv识别时，带有CAR的T细胞就会被激活(Sadelain et al.Cancer Discov 2013.3:388-398)。与TCR相比，CAR分子不受人类白细胞抗原(HLA)分子限制，因此CAR适用于具有任何HLA配型的病人。嵌合抗原受体T细胞(CAR-T)疗法已经成功地应用在多个针对血液恶性癌症的临床试验中，并且众多研究人员在积极地试验其在不同固体肿瘤治疗中的应用(Johnson et al.Cell Research 2017.27:38-58)。自体免疫细胞治疗需要利用患者自身的免疫细胞，因此在技术、生产、物流等方面具有众多挑战。适合过继性免疫治疗的患者通常已经接受多轮化疗或放疗，使得这些患者的免疫细胞功能受损，因此培养和扩增这些细胞的难度非常大。同时自体免疫细胞治疗需要个体定制化的细胞制品，针对每个患者的生产流程都需要单独的管线、空间以及一次性容器，导致自体免疫细胞疗法的成本极高。另外自体免疫细胞疗法需要将从患者体内采集分离的T细胞运送到细胞制品生产车间进行加工，再运送回至医院回输到患者体内。往返运输和生产的过程加起来需要超过一个月的时间，而在此过程中患者的病情会持续恶化，从而错过了治疗的最佳时机。自体免疫细胞疗法的这些缺点进一步限制了其应用的广泛性。基于异体免疫细胞的细胞免疫疗法具有为患者提供“现成”治疗方案的潜力，从而解决了上文提到的自体免疫细胞疗法存在的问题。从供者处获得的异体T细胞能够通过内源表达的TCR识别受体患者的同种异体抗原，从而攻击受体患者，导致致命性的移植物抗宿主反应(GvHD)。同时异体T细胞表面HLA的错配能够诱发受体患者的免疫系统对异体T细胞的快速清除(即宿主抗移植物反应，HvGR)，缩短了回输细胞在受体患者内存留时间并降低了疗效。因此制备“现成”T细胞需要成熟的技术方案来敲除TCR和HLA(即人类主要组织相容性复合体，MHC)相关基因。成簇规律间隔短回文重复序列(CRISPR)和CRISPR结合蛋白(Cas9)组成了一套强大的核酸酶系统，能够对真核细胞中几乎所有与原型间隔子邻近基序(protospacer-adjacent motif,PAM)相邻的基因组序列进行切割(Cong et al.Science 2013.339:819-823)。除了Cas9蛋白外，CRISPR/Cas9系统中包含的RNA组分是由一条CRISPR RNA(crRNA)和一条反式激活crRNA(tracrRNA)组成的双链指导RNA结构，指导Cas9蛋白切割与crRNA序列互补的DNA位点(Jinek et al.Science 2012.337:816-821)。为了进一步简化CRISPR/Cas9系统，研究人员利用工程学方法将双链指导RNA的两个组分(crRNA和tracrRNA)的部分连接成嵌合型单链指导RNA(sgRNA)(Jinek et al.Science 2012.337:816-821；Cong et al.Science 2013.339:819-823；Mali et al.Science 2013.339:823-826；Hsu et al.Nat Biotechnol 2013.31:827-832)。当靶向不同基因组位点时，只需要依据靶点的DNA序列来改变crRNA序列(或sgRNA的可变区，约20个碱基)即可，而不需改变Cas9蛋白和tracrRNA(或sgRNA的恒定区，约80个碱基)，因此通过在系统中加入不同的crRNA或sgRNA就可以实现对多个基因组位点同时进行剪切。CRISPR/Cas9系统的多点切割能力远优于其它基因编辑系统，例如锌指核酸酶系统(ZFN)和转录激活因子样效应因子核酸酶系统(TALEN)。因为针对每一个新的靶向DNA序列，这两种系统中的DNA结合蛋白都要被重新改造来实现新的靶向性功能。当CRISPR/Cas9，ZFN或TALEN等特异性核酸酶递送进细胞内后，他们会在基因组上的靶向位点处产生DNA双链断裂(double-stranded break，DSB)。细胞内的DNA修复机制可用非同源末端链接(non-homologous end-joining，NHEJ)方式修复DSB，这种修复方式会引入随机插入或缺失，破坏、敲除目标基因。当为细胞提供修复模板时，DSB可被同源定向修复(homologous directed repair，HDR)方式修复，这种方式修复后基因组序列会与模板序列一致，造成靶点处定制化的序列改变，如定点碱基突变或外源基因片段的插入。专利申请文件WO 2013/176915和WO 2015/136001披露了利用TALEN敲除TCR和I类MHC分子相关基因的技术方案。WO 2015/136001专利申请文件还列出可能靶向编码TCR的基因的三个外显子的gRNA(指导RNA)序列，但并没有展示任何关于这些gRNA介导的基因突变/敲除频率的具体数据。2016年发表于Clinical Cancer Research的文章报道，多个sgRNA的组合和编码Cas9的mRNA被用来敲除TCR基因和作为I类MHC分子重要组成部分的beta-2微球蛋白基因(B2M)，从而清除呈递于T细胞表面的TCR和I类MHC蛋白(Ren et al.Clinical Cancer Research 2016 November 4)。但在这组报道中，利用电穿孔转染法同时递送Cas9 mRNA和sgRNA只能获得小于10％TCR阴性的T细胞，而为了得到更高的基因敲除效率只能在隔天再进行一次电转染。但结果表明隔天第二次的电转染会极大影响T细胞的增殖能力，导致T细胞扩增倍数降低。而且多加一次电转染步骤会提高生产过程的复杂度和每批次细胞制品的成本。为了提高sgRNA的有效量，研究人员利用慢病毒载体将表达sgRNA的序列永久性地插入到T细胞的基因组中，从而敲除TCR和B2M基因(Ren et al.Oncotarget 2017.8:17002-17011)。但sgRNA在T细胞中的稳定和永久性的表达会导致不可预见的脱靶效应，例如RNA干扰效应，从而提高了异体细胞疗法的不可控性和潜在毒性。纯化的Cas9蛋白与体外转录或合成而得的gRNA可以预先结合，形成核糖核蛋白(RNP)复合物，并本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种CRISPR-Cas系统，包含指导RNA和Cas蛋白；其中指导RNA由下述两部分组成：/n(a)第一指导RNA，该指导RNA能与真核细胞TRAC基因中具有SEQ ID NO:1的靶序列结合；/n(b)第二和第三指导RNA，该指导RNA能分别与真核细胞B2M基因中具有SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4的靶序列中的两个序列结合。/n

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】20170714 CN 2017105745372一种CRISPR-Cas系统，包含指导RNA和Cas蛋白；其中指导RNA由下述两部分组成：
(a)第一指导RNA，该指导RNA能与真核细胞TRAC基因中具有SEQ ID NO:1的靶序列结合；
(b)第二和第三指导RNA，该指导RNA能分别与真核细胞B2M基因中具有SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4的靶序列中的两个序列结合。


权利要求1所述的CRISPR-Cas系统，其中所述的第二和第三指导RNA能分别与B2M基因中具有SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3的靶序列结合，或者与SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:4的靶序列结合，或者与SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4的靶序列结合。


权利要求1或2所述的CRISPR-Cas系统，其中所述的指导RNA是单链指导RNA。


权利要求3所述的CRISPR-Cas系统，其中所述的第一单链指导RNA序列包含5’-GUCUCUCAGCUGGUACA-3’特异性序列。


权利要求4所述的CRISPR-Cas系统，其中所述的第一单链指导RNA序列为5’-(X)n-GUCUCUCAGCUGGUACA-骨架序列-3’，其中X选自A、U、C和G的任一个碱基，n为0-15任一整数，优选n＝13，更优选n＝2。


权利要求5所述的CRISPR-Cas系统，其中所述的第一单链指导RNA序列为SEQ ID NO:8或SEQ ID NO：14。


权利要求1-6任一项所述的CRISPR-Cas系统，其中与SEQ ID NO:2靶序列结合的单链指导RNA序列包含5’-cacgcuggauagccucc-3’特异性序列，与SEQ ID NO:3靶序列结合的单链指导RNA序列包含5’-uagcgcgagcacagcua-3’特异性序列，与SEQ ID NO:4靶序列结合的单链指导RNA序列包含5’-cacggagcgagacaucu-3’特异性序列。


权利要求7所述的CRISPR-Cas系统，其中与SEQ ID NO:2靶序列结合的单链指导RNA序列为5’(X)n-cacgcuggauagccucc-骨架序列-3’，与SEQ ID NO:3靶序列结合的单链指导RNA序列为5’(X)n-uagcgcgagcacagcua-骨架序列-3’，与SEQ ID NO:4靶序列结合的单链指导RNA序列为5’-(X)n-cacggagcgagacaucu-骨架序列-3’，其中X选自A、U、C和G的任一个碱基，n为0-15任一整数，优选n＝13，更优选n＝2。


权利要求8所述的CRISPR-Cas系统，其中与SEQ ID NO:2靶序列结合的单链指导RNA序列为SEQ ID NO:15，与SEQ ID NO:3靶序列结合的单链指导RNA序列为SEQ ID NO:17，与SEQ ID NO:4靶序列结合的单链指导RNA序列为SEQ ID NO:19。


权利要...

【专利技术属性】
技术研发人员：林彦妮，徐元元，李军，
申请(专利权)人：苏州克睿基因生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏;32