一种单域抗体及包含抗体结构的嵌合抗原受体制造技术

一种靶向BCMA的抗原结合蛋白，尤其涉及一种包含该抗原结合蛋白的嵌合抗原受体，及其应用。该嵌合抗原受体包含靶向BCMA的胞外域、跨膜域和胞内结构域。该嵌合抗原受体在以BCMA作为靶点的CAR‑T疗法中对肿瘤细胞具有良好的杀伤效果。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】一种单域抗体及包含抗体结构的嵌合抗原受体
本申请涉及生物医药领域，具体的涉及一种靶向BCMA的结合结构域，以及包含靶向BCMA的结合结构域的嵌合抗原受体。
技术介绍
近年来，随着肿瘤免疫疗法和临床技术的发展，嵌合抗原受体T细胞(ChimericAntigenReceptor-Tcells，CAR-T)免疫疗法目前是最有前途的肿瘤免疫疗法之一。CAR-T疗法是一种转基因细胞疗法。通过将嵌合抗原受体(CAR)基因转入T细胞，赋予T细胞识别和杀伤靶细胞的能力。CAR是模拟TCR功能的人工受体，是CAR-T的核心部件，CAR的结构主要包括：一个抗原结合区(通常来源于单克隆抗体抗原结合区域的scFv段)、铰链区、跨膜域、共刺激域和激活域。细胞外的scFv结构域在结合表达于靶细胞表面的靶蛋白以后，激活了CAR结构的共刺激域和激活域。CAR-T同时具备激活信号和共激活信号，因此可以在杀伤肿瘤的同时高效的扩增。CAR-T细胞疗法的有效性依赖于识别抗原的抗体的特异性以及抗原结合的亲和力高低等性质。B细胞成熟抗原(B-cellmaturationantigen,BCMA)，又称为CD269或TNFRSF13(tumornecrosisfactorreceptorsuperfamilymember17)，是肿瘤坏死因子受体(TNF)超家族的成员，由185个氨基酸残基组成的Ⅲ型跨膜蛋白。BCMA可结合B细胞激活因子(BAFF)和增殖诱导配体(APRIL)，BCMA与其配体结合后，可激活B细胞的增殖和存活。作为一种极为重要的B细胞生物标志物，主要表达于成熟B淋巴细胞和浆细胞表面。BCMA的RNA在MM细胞中普遍检测到，多发性骨髓瘤患者的浆细胞表面一般可检测到BCMA蛋白。据报道，在正常细胞中，BCMA主要由浆细胞和一部分成熟B细胞表达，而在大部分B细胞以及其它器官上都不表达。因此，BCMA非常适合作为CAR-T治疗多发性骨髓瘤的靶点。以BCMA作为靶点的CAR-T疗法已经在开展临床研究，并且取得了很好的临床疗效(NoopurRajeetal.NEnglJMed.380:1726-1737(2019)；JieXuetal.PNAS.116(19):9543-9551(2019))。目前的CART疗法通常以来源于单克隆抗体抗原结合区域的scFv段作为抗原结合区。细胞外的scFv结构域在结合表达于靶细胞表面的靶蛋白以后，可以激活CAR结构的共刺激域和激活域。但是scFv分子量比较大而且容易形成多聚体，影响CAR的功能。因此，需要包含新结构的抗原结合区的CAR。
技术实现思路
本申请开发了一种针对BCMA的特异性单域抗体；并且本申请利用基因工程手段设计了特异性单域抗体作为CAR的抗原结合区进行CAR修饰及CAR-T细胞疗法，提出了一种基于单域抗体的特异性嵌合抗原受体(CAR)，其包括靶点结合结构域(胞外域)、跨膜结构域、一个或多个共刺激结构域、以及胞内信号传导结构域，其中所述胞外结构域是能结合人BCMA的抗原结合片段。单域抗体虽然结构简单，但仍然可以达到与传统抗体相当甚至更高的与特异抗原结合的亲和力。相比于传统抗体，单域抗体具有分子量小、稳定性强、易于重组表达等优点。单域抗体单个重链抗体可变区(VHH)是能完整结合抗原的单个功能域抗体片段，可在无需轻链的帮助下，对抗原具有高亲和力。VHH结构简单，被称为最小的功能性抗原结合片段，因高特异性、高亲和力、免疫原性低、渗透性好，在进行肿瘤治疗时具有接触到不能被常规抗体接触的较为隐蔽靶点的可能性。本申请的BCMA单域抗体亲和力高，部分抗体的亲和力达到10-11级别。由这些高亲和力单域抗体改造构建成的CAR-T细胞对靶细胞有更强的结合能力。此外，本申请的高亲和力BCMACAR-T细胞对肿瘤细胞的杀伤效果要优于使用scFv构建的对照CAR-T细胞。一方面，本申请提供了一种嵌合抗原受体(CAR)，其包含靶向部分，其中所述靶向部分包含互补决定区1(CDR1)、互补决定区2(CDR2)和互补决定区3(CDR3)，其中所述CDR1包含SEQIDNO:23、26、29、32、35和38中任一项所示的氨基酸序列。在某些实施方式中，所述CDR2包含SEQIDNO:24、27、30、33、36和39中任一项所示的氨基酸序列。在某些实施方式中，所述CDR3包含SEQIDNO:25、28、31、34、37和40中任一项所示的氨基酸序列。在某些实施方式中，所述CDR1、CDR2和CDR3包含选自下组中任意一组的序列：a)CDR1：SEQIDNO:23，CDR2：SEQIDNO:24，和CDR3：SEQIDNO:25；b)CDR1：SEQIDNO:26，CDR2：SEQIDNO:27，和CDR3：SEQIDNO:28；c)CDR1：SEQIDNO:29，CDR2：SEQIDNO:30，和CDR3：SEQIDNO:31；d)CDR1：SEQIDNO:32，CDR2：SEQIDNO:33，和CDR3：SEQIDNO:34；e)CDR1：SEQIDNO:35，CDR2：SEQIDNO:36，和CDR3：SEQIDNO:37；和，f)CDR1：SEQIDNO:38，CDR2：SEQIDNO:39，和CDR3：SEQIDNO:40。在某些实施方式中，所述靶向部分包括VHH。在某些实施方式中，所述靶向部分包含SEQIDNO:1-6和41-46中任一项所示的氨基酸序列。在某些实施方式中，所述的嵌合抗原受体包括跨膜域，所述跨膜域包含源自选自下组中的一种或多种蛋白的跨膜域：CD8、CD28、4-1BB、CD4、CD27、CD7、PD-1、TRAC、TRBC、CD3ε、CD3ζ、CTLA-4、LAG-3、CD5、ICOS、OX40、NKG2D、2B4、CD244、FcεRIγ、BTLA、CD30、GITR、HVEM、DAP10、CD2、NKG2C、LIGHT、DAP12，CD40L、TIM1、CD226、DR3、CD45、CD80、CD86、CD9、CD16、CD22、CD33、CD37、CD64、CD134、CD137、CD154和SLAM。在某些实施方式中，所述跨膜域包含源自CD8的跨膜域。在某些实施方式中，所述的嵌合抗原受体包括胞内共刺激信号传导结构域，所述胞内共刺激信号传导结构域包含源自选自下组中的一种或多种蛋白的胞内共刺激信号传导结构域：CD28、CD137、CD27、CD2、CD7、CD8、OX40、CD226、DR3、SLAM、CDS、ICAM-1、NKG2D、NKG2C、B7-H3、2B4、FcεRIγ、BTLA、GITR、HVEM、DAP10、DAP12、CD30、CD40、CD40L、TIM1、PD-1、LFA-1、LIGHT、JAML、CD244、CD100、ICOS、CD83的配体、CD40和MyD88。在某些实施方式中，所述胞内共刺激信号传导结构域包含源自4-1BB的共刺激信号传导结构域。在某些实施方本文档来自技高网...

【技术保护点】
嵌合抗原受体(CAR)，其包含靶向部分，其中所述靶向部分包含互补决定区1(CDR1)、互补决定区2(CDR2)和互补决定区3(CDR3)，所述CDR1包含SEQ ID NO:23、26、29、32、35和38中任一项所示的氨基酸序列。/n

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】20190926 CN 2019109188235嵌合抗原受体(CAR)，其包含靶向部分，其中所述靶向部分包含互补决定区1(CDR1)、互补决定区2(CDR2)和互补决定区3(CDR3)，所述CDR1包含SEQIDNO:23、26、29、32、35和38中任一项所示的氨基酸序列。


根据权利要求1所述的嵌合抗原受体，其中所述CDR2包含SEQIDNO:24、27、30、33、36和39中任一项所示的氨基酸序列。


根据权利要求1-2中任一项所述的嵌合抗原受体，其中所述CDR3包含SEQIDNO:25、28、31、34、37和40中任一项所示的氨基酸序列。


根据权利要求1-3中任一项所述的嵌合抗原受体，其中所述CDR1、CDR2和CDR3包含选自下组中任意一组的氨基酸序列：
a)CDR1：SEQIDNO:23，CDR2：SEQIDNO:24，和CDR3：SEQIDNO:25；
b)CDR1：SEQIDNO:26，CDR2：SEQIDNO:27，和CDR3：SEQIDNO:28；
c)CDR1：SEQIDNO:29，CDR2：SEQIDNO:30，和CDR3：SEQIDNO:31；
d)CDR1：SEQIDNO:32，CDR2：SEQIDNO:33，和CDR3：SEQIDNO:34；
e)CDR1：SEQIDNO:35，CDR2：SEQIDNO:36，和CDR3：SEQIDNO:37；和
f)CDR1：SEQIDNO:38，CDR2：SEQIDNO:39，和CDR3：SEQIDNO:40。


根据权利要求1-4中任一项所述的嵌合抗原受体，其中所述靶向部分包括VHH。


根据权利要求1-5中任一项所述的嵌合抗原受体，其中所述靶向部分包括SEQIDNO:1-6和41-46中任一项所示的氨基酸序列。


根据权利要求1-6中任一项所述的嵌合抗原受体，其包括跨膜域，所述跨膜域包含源自选自下组中的一种或多种蛋白的跨膜域：CD8、CD28、4-1BB、CD4、CD27、CD7、PD-1、TRAC、TRBC、CD3ε、CD3ζ、CTLA-4、LAG-3、CD5、ICOS、OX40、NKG2D、2B4、CD244、FcεRIγ、BTLA、CD30、GITR、HVEM、DAP10、CD2、NKG2C、LIGHT、DAP12，CD40L、TIM1、CD226、DR3、CD45、CD80、CD86、CD9、CD16、CD22、CD33、CD37、CD64、CD134、CD137、CD154和SLAM。


根据权利要求7所述的嵌合抗原受体，其中所述跨膜域包含源自CD8的跨膜域。


根据权利要求1-8中任一项所述的嵌合抗原受体，其包括胞内共刺激信号传导结构域，所述胞内共刺激信号传导结构域包含源自选自下组中的一种或多种蛋白的胞内共刺激信号传导结构域：CD28、CD137、CD27、CD2、CD7、CD8、OX40、CD226、DR3、SLAM、CDS、ICAM-1、NKG2D、NKG2C、B7-H3、2B4、FcεRIγ、BTLA、GITR、HVEM、DAP10、DAP12、CD30、CD40、CD40L、TIM1、PD-1、LFA-1、LIGHT、JAML、CD244、CD100、ICOS、CD83的配体、CD40和MyD88。


根据权利要求9所述的嵌合抗原受体，其中所述胞内共刺激信号传导结构域源自4-1BB的共刺激信号传导结构域。


根据权利要求1-10中任一项所述的嵌合抗原受体，其包括胞内信号转导结构域，所述胞内信号转导结构域包含源自选自下组中的一种或多种蛋白的胞内信号转导结构域：CD3ζ、CD3δ、CD3γ、CD3ε、CD79a、CD79b、FceRIγ、FceRIβ、FcγRIIa、牛白血病病毒gp30、Epstein-Barr病毒(EBV)LMP2A、猿免疫缺陷病毒PBj14Nef、卡波西肉瘤疱疹病毒(HSKV)、DAP10、DAP-12和至少包含一个ITAM的结构域。


根据权利要求11所述的嵌合抗原受体，其中所述胞内信号转导结构域包含源自CD3的信号传导结构域。


根据权利要求7-12中任一项所述的嵌合抗原受体，其在靶向部分和跨膜域之间包括铰链区，所述铰链区包含源自选自下组中的一种或多种蛋白的铰链区：CD28、IgG1、IgG4、IgD、4-1BB、CD4、CD27、CD7、CD8、PD-1、ICOS、OX40、NKG2D、NKG2C、FcεRIγ、BTLA、GITR、DAP10、CD40L、TIM1、CD226、SLAM、CD30和LIGHT。


根据权利要求13所述的嵌合抗原受体，所述铰链区包含源自CD8的铰链区。


根据权利要求1-14中任一项所述的嵌合抗原受体，其包含SEQIDNO:7-12和53-58中任一项所示的氨基酸序列。


分离的抗原结合蛋白，其包含互补决定区1(CDR1)、互补决定区2(CDR2)和互补决定区3(CDR3)，其中所述CDR1包含SEQIDNO:23、26、29、32、35和38中任一项所示的氨基酸序列。


根据权利要求16所述的分离的抗原结合蛋...

【专利技术属性】
技术研发人员：王文博，冯爱华，郭佩佩，林彦妮，
申请(专利权)人：苏州克睿基因生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏;32