人血清白蛋白与白介素2的融合蛋白及其用途制造技术

本发明专利技术涉及人血清白蛋白(特别是野生型人血清白蛋白)与人白介素‑2(特别是突变型人白介素‑2)的融合蛋白。所述融合蛋白具有相对于重组白介素‑2显著延长的体内半衰期，从而能够单独用于治疗肿瘤。而且，所述融合蛋白能够显著提高抗PD‑1抗体或抗PD‑L1抗体的抗肿瘤功效。

【技术实现步骤摘要】
人血清白蛋白与白介素2的融合蛋白及其用途
本专利技术涉及人血清白蛋白(特别是野生型人血清白蛋白)与人白介素-2(特别是突变型人白介素-2)的融合蛋白。所述融合蛋白具有相对于重组白介素-2显著延长的体内半衰期，从而能够单独用于治疗肿瘤。而且，所述融合蛋白能够显著提高抗PD-1抗体或抗PD-L1抗体的抗肿瘤功效。
技术介绍
(一)人血清白蛋白(HSA)是一种可溶性单体蛋白质，构成血液中蛋白总量的一半。白蛋白作为一种基本载体，携带传递脂肪酸、类固醇和激素分子等，其稳定的惰性性质是维持血压的一个重要因素。血清白蛋白是一种球状非糖基化的、分子量为65千道尔顿、具有585个氨基酸的血清蛋白质。这一蛋白(白蛋白前体)再通过高尔基体的转化加工，去除引导多肽，而分泌到细胞外。血清白蛋白有35个半胱氨酸，在血液中，白蛋白是一个有17个二硫键的单体(参见BrownJR,“Albuminstructure,Function,andUses”Pergamon,N.Y.，1977)。当没有分泌多肽时，在酵母细胞内的白蛋白产物是错配状态，将失去90％的抗原性(与血浆中自然状态白蛋白相比)，并且形成不溶性的白蛋白聚合体，不具有白蛋白的生物活性。现在用于临床的白蛋白均是从人血浆中提取的。利用微生物，特别是毕赤酵母工程菌生产重组表达白蛋白(rHSA)已在于在林、富岩中国授权专利ZL2004010057313.7中公开。白蛋白是血液中的主要成分，在人体内含量为每升血液含40克，其半衰期寿命为20天。在药物制剂组成中，白蛋白也常被用作药物的稳定剂，尤其是生物药和疫苗的制造。综上所述，利用基因工程技术，将人血清白蛋白与治疗性蛋白质基因融合在酵母菌或脊椎动物细胞中表达为重组融合蛋白后，该融合蛋白将具有极大的优势使之可抵御生物体内酶解作用，并可使治疗性蛋白质在体内体外的寿命大大提高，也就是可增加治疗性蛋白质在血清中和储存时的稳定性和较长的半衰期，达到蛋白药物的长效化，大大减少给药频率,在重大疾病临床治疗中获得更好的治疗效果(于在林、富岩，更优生物创新药-重组人血清白蛋白融合蛋白，中国医药生物技术，2017,12(3):248-264)。(二)人白细胞介素2(Interleukin-2,IL-2)是一种天然的细胞因子，1976年由DorisA.Morgan等人首次发现。由活化的T淋巴细胞(辅助型T细胞)在抗原或有丝分裂刺激下产生，IL-2具有免疫调节活性，对机体免疫系统有直接增强上调作用功能，也对抗体依赖性的免疫调节或体液(细胞)免疫反应均具有上调增强机制，IL-2是人体至关重要的细胞因子之一。IL-2具有4个反平行的、两亲性α螺旋，此4个α螺旋形成其功能必不可少的四级结构。IL-2通过三种不同受体起作用：IL-2受体α(IL-2Rα；CD25)具显著刺激和增强细胞因子产生和快速释放的体内作用功能，也是过量增强时导致细胞因子风暴，免疫过激反应的关键细胞因子。IL-2受体β(IL-2Rβ；CD122)和白介素-2受体γ(IL-2Rγ；CD132)，则对于IL-2的信号传导，特别是抑制肿瘤细胞生长起着至关重要的作用。IL-2在人血清白蛋白的不同端直接融合，以及IL-2经氨基酸替换(变异)后，并与白蛋白形成一种融合蛋白，就可产生意想不到的长效性，避免产生细胞因子风暴的形成、增强或不降低其与IL-2Rβ/γ的结合能力，产生抑制肿瘤细胞生长等新的生物学功能，这可在临床肿瘤治疗中发生显著新临床应用功能(疗效)。重组人白细胞介素-2，又称Aldesleukin(Proleukin)，是一种有效的抗癌药物。其血液半衰期仅3.5h左右，临床血液频繁给药，不利于患者的依从性和临床疗效。重组白介素-2的上市药品与表达于免疫细胞表面的高亲和性IL-2受体相互作用，刺激细胞因子大量释放，包括各种干扰素、白细胞介素、肿瘤坏死因子(Tumornecrosisfactors，TNF)和其它细胞因子，诱导多种细胞增殖和分化，包括B和T细胞,单核细胞、巨噬细胞和自然杀伤(NK)细胞、细胞毒性T细胞、肿瘤浸润淋巴细胞(tumorinfiltratinglymphocytes，TIL)和淋巴因子激活杀伤细胞(lymphokineactivatedkiller，LAK)。IL-2抗肿瘤活性被认为是细胞毒性淋巴细胞激活的结果。IL-2药物提高白介素-1、肿瘤坏死因子α/β、γ干扰素和白介素-6的水平。IL-2通过与细胞表面受体结合作用于免疫细胞，IL-2与受体相互作用的数量和性质决定了对细胞影响的大小。天然的IL-2能激活β和γ受体细胞发挥抗肿瘤活性,但是天然IL-2会优先结合免疫细胞上的α受体(CD25)，这些免疫细胞就会引起很大的副作用,如严重毒性和免疫抑制，形成细胞因子风暴。rIL-2有很大毒副作用，包括危及生命的、有时是致命的血管泄漏综合征(vascularleaksyndrome，VLS)，以及它的半衰期短，需要每天给药3次，疗程超过8天，限制了它的临床用途。临床上患者有对具药物长效化的显著临床需求。到目前为止，所有批准的IL-2疗法，包括aldesleukin,CAR-T都会有优先激活非靶细胞的特征，这也是其在临床应用上受到巨大限制的缘故。IL-2免疫治疗已在各种临床试验中得到证实，IL-2单独或与LAK联合使用，可抑制不同免疫原性和非免疫原性小鼠癌症的肺和肝转移的发展。对晚期癌症患者的早期研究显示，单独或联合LAK的高剂量IL-2治疗可介导癌症的完全或部分消退。为改善IL-2与IL-2的α受体相结合产生的严重细胞因子风暴，形成严重的毒副反应和免疫激荡，科学家开展了各种各样的创新性研发，例如类IL-2样的药物NKTR-214、ALKS4230、THOR-707等，其研发过程都可谓一波三折，并不稳定。1.Nektar公司研发的新药NKTR-214，是一种CD122偏向性细胞因子激动剂，与聚乙二醇(polyethyleneglycol，PEG)结合，旨在通过异二聚体IL-2受体途径(IL-2R)提供持续信号，由调节型T细胞(regulatoryTcells，Treg)优先激活和扩大CD8+T和NK效应细胞。NKTR-214单独用药试验失败。Plainview报告表明，NKTR-214单药疗法在EXCEL试验与以前的IL-2单药疗法总有效率(OverallResponseRate，ORR)为15-29％相比，显示出0％的ORR(0/28)。淋巴细胞需要增加200-300％时才能达到临床疗效，但NKTR-214只能提高33-50％的淋巴细胞，其治疗效果太弱。2.ALKS4230是Alkermes公司研发的另一种白细胞介素-2样药物，一种由循环排列的IL-2和IL-2受体(IL-2R)组成的工程融合蛋白，用于选择性激活具有中度亲性的IL-2R。ALKS4230的选择性旨在克服其局限性的同时，充分利用IL-2疗法的抗肿瘤作用。第一阶段研究的初始数据显示出ALKS4230的独特机制，对循环自然杀伤细胞和CD8+T细胞具有剂量依赖性药效效应，对免疫抑制调节性T细胞具有最小和非剂量本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种融合蛋白，其包含人血清白蛋白成熟肽和人白介素-2成熟肽，其中所述人血清白蛋白成熟肽和所述人白介素-2成熟肽直接连接或经由肽接头间接连接，/n其中所述人白介素-2成熟肽以其C端与所述人血清白蛋白成熟肽的N端融合或所述人白介素-2成熟肽以其N端与所述人血清白蛋白成熟肽的C端融合，/n其中所述人白介素-2成熟肽具有野生型人白介素-2成熟肽序列或相对于野生型人白介素-2成熟肽序列包含下述替代中的一项或多项的突变型人白介素-2成熟肽序列：T3A、R38A、F42A、Y45A、E62A、L72G和C125A，其中所述野生型人白介素-2成熟肽序列任选如SEQID NO.10所示，/n其中所述人血清白蛋白成熟肽具有野生型人血清白蛋白成熟肽序列，任选如SEQ IDNO.9所示，或所述人血清白蛋白成熟肽具有突变型人血清白蛋白成熟肽序列。/n

【技术特征摘要】
1.一种融合蛋白，其包含人血清白蛋白成熟肽和人白介素-2成熟肽，其中所述人血清白蛋白成熟肽和所述人白介素-2成熟肽直接连接或经由肽接头间接连接，
其中所述人白介素-2成熟肽以其C端与所述人血清白蛋白成熟肽的N端融合或所述人白介素-2成熟肽以其N端与所述人血清白蛋白成熟肽的C端融合，
其中所述人白介素-2成熟肽具有野生型人白介素-2成熟肽序列或相对于野生型人白介素-2成熟肽序列包含下述替代中的一项或多项的突变型人白介素-2成熟肽序列：T3A、R38A、F42A、Y45A、E62A、L72G和C125A，其中所述野生型人白介素-2成熟肽序列任选如SEQIDNO.10所示，
其中所述人血清白蛋白成熟肽具有野生型人血清白蛋白成熟肽序列，任选如SEQIDNO.9所示，或所述人血清白蛋白成熟肽具有突变型人血清白蛋白成熟肽序列。


2.权利要求1的融合蛋白，其中
(a)所述突变型人白介素-2成熟肽序列相对于野生型人白介素-2成熟肽序列包含T3A、F42A、Y45A、L72G和C125A替代并以其C端与人血清白蛋白成熟肽的N端直接连接；或
(b)所述突变型人白介素-2成熟肽序列相对于野生型人白介素-2成熟肽序列包含T3A、R38A、F42A、Y45A、E62A、L72G和C125A替代并以其N端与人血清白蛋白成熟肽的C端直接连接。


3.权利要求1的融合蛋白，其具有SEQIDNO.1、SEQIDNO.3、SEQIDNO.5或SEQIDNO.7的氨基酸序列。


4.权利要求1-3任一项的融合蛋白，其具有下述一项或多项特性：
(a)具有与野生型人白介素-2相比减弱的人IL-2α受体(C...

【专利技术属性】
技术研发人员：于在林，富岩，杨小楠，富俞淞，乔国强，侯琼，朱涛，
申请(专利权)人：天津林达生物科技有限公司，中美福源生物技术北京股份有限公司，天津溥瀛生物技术有限公司，北京美福源生物医药科技有限公司，
类型：发明
国别省市：天津;12