一种用于治疗儿童矮小症的重组人血清白蛋白/生长激素融合蛋白的制备纯化方法技术

本发明专利技术公开了一种重组人血清白蛋白/生长激素融合蛋白、该重组融合蛋白制备纯化方法、以及该重组融合蛋白在制备治疗儿童矮小症药物中的用途。所述重组人血清白蛋白/生长激素融合蛋白的氨基酸序列为SEQ ID NO.1，核酸序列为SEQ ID NO.2。本发明专利技术的制备工艺通过构建表达酵母工程菌从而获得高密度表达重组融合蛋白，并且通过纯化工艺，获得了可供临床上使用的重组人血清白蛋白/生长激素融合蛋白。通过本发明专利技术制备纯化方法获得的重组人血清白蛋白/生长激素融合蛋白是一种用于儿童矮小症治疗的创新药物结构，其达到具有可两周给药一次的长效性，更适合儿童用药的要求，并具有更优的疗效、更少的给药频次、更低的生产成本。

Preparation and Purification of Recombinant Human Serum Albumin/Growth Hormone Fusion Protein for the Treatment of Children's Dwarfness

The invention discloses a recombinant human serum albumin/growth hormone fusion protein, a preparation and purification method of the recombinant fusion protein, and the use of the recombinant fusion protein in preparing medicines for treating children's dwarfness. The amino acid sequence of the recombinant human serum albumin/growth hormone fusion protein is SEQ ID NO.1 and the nucleic acid sequence is SEQ ID NO.2. The preparation process of the present invention obtains high-density expression recombinant fusion protein by constructing yeast engineering bacteria, and obtains recombinant human serum albumin/growth hormone fusion protein for clinical use by purification process. The recombinant human serum albumin/growth hormone fusion protein obtained by the preparation and purification method of the present invention is an innovative drug structure for the treatment of children's dwarfness. The recombinant human serum albumin/growth hormone fusion protein achieves the long-term efficacy of two-week administration, is more suitable for the requirements of children's medication, and has better curative effect, fewer administration frequency and lower production cost.

【技术实现步骤摘要】
一种用于治疗儿童矮小症的重组人血清白蛋白/生长激素融合蛋白的制备纯化方法
本专利技术涉及生物
，更具体地是一种用于治疗儿童矮小症的重组人血清白蛋白/生长激素融合蛋白及其制备纯化方法和其在制备治疗儿童矮小症药物中的用途。
技术介绍
人血清白蛋白（HSA）是一种可溶性单体蛋白质，构成血液中蛋白总量的一半。白蛋白作为一种基本载体，携带传递脂肪酸、类固醇和激素分子等，其稳定的惰性性质是维持血压的一个重要因素。血清白蛋白是一种球状非糖基化的、分子量为65千道尔顿、具有585个氨基酸的血清蛋白质。这一蛋白（白蛋白前体）再通过高尔基体的转化加工，去除引导多肽，而分泌到细胞外。血清白蛋白有35个半胱氨酸，在血液中，白蛋白是一个有17个二硫键的单体（参见BrownJR,“白蛋白的结构、功能和应用”Pergamon,纽约，1977）。当没有分泌多肽时，在酵母细胞内的白蛋白产物是错配状态，将失去90%的抗原性（与血浆中自然状态白蛋白相比），并且形成不溶性的白蛋白聚合体，不具有白蛋白的生物活性。现在用于临床的白蛋白均是从人血浆中提取的。利用微生物重组表达白蛋白（rHSA）的生产已在专利EP330451、EP361991和于在林、富岩中国授权专利ZL2004010057313.7中公开。白蛋白是血液中的主要成分，在人体内含量为每升血液含40克，其半衰期寿命为14-20天。在药物制剂组成中，白蛋白也常被用作药物的稳定剂，尤其是生物药和疫苗的制造。综上所述，利用基因工程技术，将人血清白蛋白与治疗性蛋白质基因融合在酵母菌或脊椎动物细胞中表达为重组融合蛋白后，该融合蛋白将具有极大的优势使之可抵御生物体内酶解作用，并可使治疗性蛋白质在体内体外的寿命大大提高，也就是可增加治疗性蛋白质在血清中和储存时的稳定性和较长的半衰期，达到蛋白药物的长效化，大大减少给药频率,在重大疾病临床治疗中获得更好的治疗效果。人生长激素(humangrowthhormone,hGH)是人脑垂体前叶分泌的一种蛋白质激素.它不仅有促进生长的作用,而且与机体的合成代谢密切相关,是治疗侏儒症、烧伤、创伤、骨折、出血性溃疡的重要药物。由于其体内半衰期仅为0.5～2hr左右，故需要每天、长期注射（数年，5-10年）给药才能发挥疗效，治疗周期长更需要药物长效化。为此，市场急需长效化、特别是适合于儿童的长效药。基因重组的长效重组人血清白蛋白/生长激素融合蛋白是具有与人体内源生长激素同等的作用，刺激骨骺端软骨细胞分化、增殖，刺激软骨基质细胞增长，刺激成骨细胞分化、增殖，引起线形生长加速及骨骼变宽。促进全身蛋白质合成，纠正手术等创伤后的负氮平衡状态，纠正重度感染及肝硬化等所致的低蛋白血症；刺激免疫球蛋白合成，刺激淋巴样组织，巨噬细胞和淋巴细胞的增殖，增强抗感染能力；刺激烧伤创面及手术切口胶原体细胞合成纤维细胞，巨噬细胞分裂增殖，加速伤口愈合，促进心肌蛋白合成，增加心肌收缩力，降低心肌耗氧量，调节脂肪代谢，降低血清胆固醇、低密度脂蛋白的水平；补充生长激素不足或缺乏，调节成人的脂肪代谢、骨代谢、心肾功能。临床上可用于治疗如下主要适应症。1、用于因内源性生长激素缺乏所引起的儿童生长缓慢；2、用于重度烧伤治疗；3、用于已明确的下丘脑-垂体疾病所致的生长激素缺乏症和经两种不同的生长激素刺激试验确诊的生长激素显著缺乏。1985年，每天给药一次的重组人生长激素(rhGH)获得了批准上市销售，取代基于安全考虑而已停用的人垂体源性生长激素，成为一种可以无限获取的人生长激素资源。在随后的20年里，主要是在rhGH生产商的支持下，儿科内分泌科医师率先开展了一系列的临床试验以试图证明rhGH治疗可以改善因某些疾病而非生长激素缺乏(GHD)所致身材矮小患儿的生长速率及最终身高，这些疾病包括特纳综合征(TS)、慢性肾功能不全(CRI)、小于胎龄儿(SGA)、普－威综合征(PWS)或特发性身材矮小(ISS)。虽然重组人生长激素达到临床治疗的目的，但是由于给药频次为每天一次，儿童用药时间又至少要1-3年，患者依从度极低，治疗费用又是巨大一般家庭是难于按医嘱要求配合治疗，使得受药人群大大受限。为此，PEG化重组人生长激素面世，虽然可以做到每周给药一次，但费用则是普通重组人生长激素的数倍，而且在制剂还含有苯酚作为蛋白质制剂配方组分。为此本专利技术以此为技术创新，希望获得儿童患者可以每两周给药一次，生产制备费用是PEG-化生长激素的1/100，患者依从度将会大大提高，治疗费用会大大降低的创新药物结构。本专利技术将有利于更多急需要治疗，而在依从度和治疗费用限制用药的人群接受必须的治疗，为此获得意想不到的技术优势和创造性。
技术实现思路
本专利技术就是为了解决上述技术问题，所提出的一种用于治疗儿童矮小症的重组人血清白蛋白/生长激素融合蛋白的制备纯化方法。本专利技术是按照以下技术方案实现的。一种用于治疗儿童矮小症的重组人血清白蛋白/生长激素融合蛋白，所述重组人血清白蛋白/生长激素融合蛋白的氨基酸序列为SEQIDNO.1。进一步的，所述重组人血清白蛋白/生长激素融合蛋白的核酸序列为SEQIDNO.2。进一步的，所述重组人血清白蛋白/生长激素融合蛋白基因通过重组工程宿主细胞表达；所述重组工程宿主细胞为酵母菌、CHO细胞、植物、昆虫、细菌或者动物细胞；重组人血清白蛋白/生长激素融合蛋白基因通过质粒DNA载体表达、病毒载体表达、或转基因技术转移到植物和动物体内表达。进一步的，所述重组人血清白蛋白/生长激素融合蛋白基因选用基因工程技术构建来表达；获得融合蛋白的方法是利用载体质粒，通过转化和转染或感染的方式来表达重组融合蛋白。进一步的，所述重组人血清白蛋白/生长激素融合蛋白基因选用酵母表达载体来转化毕氏酵母，并使融合蛋白分泌到培养液中。进一步的，所述重组人血清白蛋白/生长激素融合蛋白基因表达的酵母属宿主为毕氏酵母属巴斯德菌种。一种上述用于治疗儿童矮小症的重组人血清白蛋白/生长激素融合蛋白的高密度表达方法，包括以下步骤：a．重组人血清白蛋白/生长激素融合蛋白载体质粒的构建及表达以人胎肝中提取的总RNA为模板，利用反转录多聚酶链聚合反应来合成、扩增HSA基因；经电泳分离纯化HSADNA片断，将其克隆至酵母表达表达载体，获得pYZ-HSA重组质粒；采用DNA全序列合成法来人工合成GH核苷酸序列；用酶切合成的目的基因GH和pYZ-HSA重组质粒，并将二者进行连接，获得pYZ-HSA/GH重组质粒；b．毕赤酵母表达工程菌的转化和制备将pYZ-HSA/GH重组质粒经PmeI限制性内切酶处理后点转入毕氏酵母X33感受态细胞，转化后的酵母菌接种于含Zeocin抗生素的YPD平板培养基上进行培养；c．重组酵母工程菌的筛选将数个含有待表达基因的酵母菌落分别在含有Zeocin抗生素，具有缓冲能力及甘油的基本培养液中培养；培养一段时候后离心收集菌体，菌体再重悬于不含甘油的同种基本培养液内，含0.5%甲醇；每24小时加入100%甲醇至最终浓度为0.5%，在不同的时间点分别收集培养上清液，筛选表达特异蛋白的重组酵母工程菌株；d.大规模高密度表达rHSA/GH融合蛋白使用500L和1000L生物发酵罐系统，取一支工程菌种子库，小规模摇床培养开始，然后扩增到一级种子罐、二级本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种用于治疗儿童矮小症的重组人血清白蛋白/生长激素融合蛋白，其特征在于：所述重组人血清白蛋白/生长激素融合蛋白的氨基酸序列为SEQ ID NO.1。

【技术特征摘要】
1.一种用于治疗儿童矮小症的重组人血清白蛋白/生长激素融合蛋白，其特征在于：所述重组人血清白蛋白/生长激素融合蛋白的氨基酸序列为SEQIDNO.1。2.根据权利要求1所述的一种用于治疗儿童矮小症的重组人血清白蛋白/生长激素融合蛋白，其特征在于：所述重组人血清白蛋白/生长激素融合蛋白的核酸序列为SEQIDNO.2。3.根据权利要求2所述的一种用于治疗儿童矮小症的重组人血清白蛋白/生长激素融合蛋白，其特征在于：所述重组人血清白蛋白/生长激素融合蛋白基因通过重组工程宿主细胞表达；所述重组工程宿主细胞为酵母菌、CHO细胞、植物、昆虫、细菌或者动物细胞；重组人血清白蛋白/生长激素融合蛋白基因通过质粒DNA载体表达、病毒载体表达、或转基因技术转移到植物和动物体内表达。4.根据权利要求3所述的一种用于治疗儿童矮小症的重组人血清白蛋白/生长激素融合蛋白，其特征在于：所述重组人血清白蛋白/生长激素融合蛋白基因选用基因工程技术构建来表达；获得融合蛋白的方法是利用载体质粒，通过转化和转染或感染的方式来表达重组融合蛋白。5.根据权利要求4所述的一种用于治疗儿童矮小症的重组人血清白蛋白/生长激素融合蛋白，其特征在于：所述重组人血清白蛋白/生长激素融合蛋白基因选用酵母表达载体来转化毕氏酵母，并使融合蛋白分泌到培养液中。6.根据权利要求5所述的一种用于治疗儿童矮小症的重组人血清白蛋白/生长激素融合蛋白，其特征在于：所述重组人血清白蛋白/生长激素融合蛋白基因表达的酵母属宿主为毕氏酵母属巴斯德菌种。7.一种权利要求1-6所述用于治疗儿童矮小症的重组人血清白蛋白/生长激素融合蛋白的高密度表达方法，其特征在于，包括以下步骤：a．重组人血清白蛋白/生长激素融合蛋白载体质粒的构建及表达以人胎肝中提取的总RNA为模板，利用反转录多聚酶链聚合反应来合成、扩增HSA基因；经电泳分离纯化HSADNA片断，将其克隆至酵母表达表达载体，获得pYZ-HSA重组质粒；采用DNA全序列合成法来人工合成GH核苷酸序列；用酶切合成的目的基因GH和pYZ-HSA重组质粒，并将二者进行连接，获得pYZ-HSA/GH重组质粒；b．毕赤酵母表达工程菌的转化和制备将pYZ-HSA/GH重组质粒经PmeI限制性内切酶处理后点转入毕氏酵母X33感受态细胞，转化后的酵母菌接种于含Zeocin抗生素的YPD平板培养基上进行培养；c．重组酵母工程菌的筛选将数个含有待表达基因的酵母菌落分别在含有Zeocin抗生素，具有缓冲能力及甘油的基本培养液中培养；培养一段时候后离心收集菌体，菌体再重悬于不含甘油的同种基本培养液内，含0.5%甲醇；每24小时加入100%甲醇至最终浓度为0.5%，在不同的时间点分别收集培养上清液，筛选表达特异蛋白的重组酵母工程菌株；d.大规模高密度表达rHSA/GH融合蛋白使用500L和1000L生物发酵罐系统，取一支工程菌种子库，小规模摇床培养开始，然后扩增到一级种子罐、二级种子罐，进入生产发酵罐；经培养至罐内甘油消耗尽，溶氧随之回至底限再回升时，启动甘油流加；待流加结束，溶氧再回升时，启动甲醇流加，...

【专利技术属性】
技术研发人员：侯琼，杨小楠，陈颖，富岩，于在林，
申请(专利权)人：天津林达生物科技有限公司，天津溥瀛生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：天津,12