一种抗人B7-H3单克隆抗体的制备方法及其免疫组化检测方法及其应用及其试剂盒技术

本发明专利技术公开了一种抗人B7‑H3单克隆抗体，包括重链和轻链，所述重链可变区(mVH)的氨基酸序列与SEQ ID NO.1相同，具体如下：EVQLVESGGGLVKPGGSLKLSCAASGFTFSRYAMSWVRQTPEKRLEWVATISDDGRNTYDRDSVKGRFTISRDNARNTLYLQMSSLRSEDTALYYCVRHRAITTARFDYWGQGTSLTVSS；所述轻链可变区(mVL)的氨基酸序列与SEQ ID NO.2相同，具体如下：DILMTQSPSSMSVSLGDTVSITCHASQDISSNIGWLQQGPGNSFKGLIYHGTNLEDGVPSRFSGSGSGADYSLTISGLESEDFADYYTLQSVQFPYTFGGGTKLEIK。本发明专利技术还公开了其检测方法、应用及试剂盒。本发明专利技术提供的抗人B7‑H3单克隆抗体可以用于肿瘤组织的免疫组化检测，提高肿瘤标本免疫组化检测的精确度，有助于恶性肿瘤的诊断、确定原发部位和病理分型，提高肿瘤尤其是低分化或未分化肿瘤的诊断准确率。

Preparation and immunohistochemical detection of a monoclonal antibody against human B7-H3 and its application and kit

The invention discloses a monoclonal antibody against human B7 8209H3, including heavy and light chains, and the amino acid sequence of the heavy chain variable region (mVH) is the same as SEQ ID NO.1, as follows: EVQLVESGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGNO.2 phase Similarly, the details are as follows: DILMTQSPSSMSVSLGDTVSITCHASQDISSNIGWLQGPGNSFKGLIYHGTNLED GVPSRFSGSGADYSLTISGLESEDFADYTLQSVFPYTFGGTKLEIK. The invention also discloses a detection method, an application and a kit thereof. The monoclonal antibody against human B7 H3 provided by the invention can be used for the immunohistochemical detection of tumor tissues, improve the accuracy of the immunohistochemical detection of tumor specimens, contribute to the diagnosis of malignant tumors, determine the primary location and pathological typing, and improve the diagnostic accuracy of tumors, especially poorly differentiated or undifferentiated tumors.

【技术实现步骤摘要】
一种抗人B7-H3单克隆抗体的制备方法及其免疫组化检测方法及其应用及其试剂盒
本专利技术涉及生物
，具体涉及一种抗人B7-H3单克隆抗体的制备方法及其免疫组化检测方法及其应用及其试剂盒。
技术介绍
近年来，越来越多的研究发现，B7-H3分子异常表达在各种肿瘤组织，如卵巢癌、乳腺癌、肺癌、肾癌、结直肠癌、前列腺癌等。临床回顾性病例分析发现，B7-H3的表达与临床病理学特征存在相关性，通过生存分析发现高表达B7-H3的病例预后差，死亡率高，并且在肿瘤患者外周血中也发现了高水平的可溶性B7-H3（sB7-H3）。此外，研究还发现，B7-H3与移植免疫排斥和自身免疫病理相关，转染了B7-H3基因的移植物可以抑制宿主T细胞的活性，从而延长移植物的生存时间。这些研究结果都提示，B7-H3是个重要的负性共刺激分子，具有重要的研究和运用价值。人类很多肿瘤中，B7-H3在mRNA和蛋白水平上均有表达并且与病人的预后呈负相关。目前已有不少文献对各类肿瘤进行回顾性研究，从临床角度分析B7-H3在抗肿瘤免疫中的功能，包括卵巢癌、食管癌、肾癌、胃癌、肝癌、肺癌、结肠癌、胰腺癌、乳腺癌、前列腺癌和黑色素瘤。B7-H3异常表达于肿瘤组织或肿瘤患者的外周血中，并和年龄、病理类型、肿瘤生物学效应和患者生存率密切相关。因此，研制鼠抗人B7-H3单克隆抗体可以为进一步研究该分子在肿瘤中的作用奠定物质基础，同时也为探明B7-H3信号传导通路及机制提供有效的研究手段，有功能的抗人B7-H3单克隆抗体更有望成为肿瘤生物治疗的潜在靶点。
技术实现思路
为了克服现有技术当中的缺陷，本专利技术的目的之一在于提供一种抗人B7-H3单克隆抗体。本专利技术的目的之二在于提供一种抗人B7-H3抗体在重链和轻链可变区的检测方法。本专利技术的目的之三在于提供一种抗人B7-H3单克隆抗体的应用。本专利技术的目的之四在于提供一种抗人B7-H3单克隆抗体的试剂盒。为了实现本专利技术的目的之一，所采用的技术方案是：一种抗人B7-H3单克隆抗体，包括重链和轻链，其中，所述重链可变区(mVH)的氨基酸序列与SEQIDNO.1相同，具体如下：EVQLVESGGGLVKPGGSLKLSCAASGFTFSRYAMSWVRQTPEKRLEWVATISDDGRNTYDRDSVKGRFTISRDNARNTLYLQMSSLRSEDTALYYCVRHRAITTARFDYWGQGTSLTVSS；所述轻链可变区(mVL)的氨基酸序列与SEQIDNO.2相同，具体如下：DILMTQSPSSMSVSLGDTVSITCHASQDISSNIGWLQQGPGNSFKGLIYHGTNLEDGVPSRFSGSGSGADYSLTISGLESEDFADYYTLQSVQFPYTFGGGTKLEIK。在本专利技术的一个优选实施例中，所述所述重链可变区(mVH)具有三个高变区为：GFTFSRYA、ISDDGRNT、VRHRAITTARFDY。在本专利技术的一个优选实施例中，所述轻链可变区(mVL)具有三个高变区为：QDISSN、HGT、LQSVQFPYT。为了实现本专利技术的目的之二，所采用的技术方案是：一种抗人B7-H3抗体在重链和轻链可变区的检测方法，包括如下步骤：（1）B7-H3单克隆抗体的杂交瘤的制备；（1.1）免疫小鼠；（1.2）细胞培养；（1.3）融合与筛选；（2）B7-H3鼠/人嵌合抗体的制备；（2.1）提取杂交瘤细胞的cDNA：从该杂交瘤细胞株中提取RNA，并使用RT-PCR技术，将获得的RNA反转录为cDNA；利用特定设计的上下游引物PCR克隆该杂交瘤细胞的重链可变区(mVH)和轻链可变区(mVL)；所述特定设计的上下游引物的序列分别为核苷酸SEQIDNO.3和核苷酸序列4；（2.2）所述重链可变区(mVH)和轻链可变区(mVL)分别与克隆载体(pJETcloningvector)连接，连接产物转化感受态细菌DH5a，由于pJET载体带有氨苄(Amp+)抗性基因，可将转化菌液涂在Amp抗性的LB固体培养基上，37°过夜培养；（2.3）待涂板细菌长出分散菌落，选择边缘清晰、生长良好的菌落，进一步测序鉴定；（2.4）根据测序结果保留候选的重链可变区(mVH)和轻链可变区(mVL)序列，再次PCR扩增出与表达载体匹配的重链可变区(mVH)和轻链可变区(mVL)序列，将PCR产物与双酶切预先处理的线性表达载体连接，连接产物转化感受态细菌DH5a，由于表达载体带有卡那霉素(Kana+)抗性基因，可将转化菌液涂在Kana抗性的LB固体培养基上，37°过夜培养；（2.5）测序方法参照（2.4）对比两次测序结果，挑选正确序列的转化菌，扩大培养后进行质粒抽提；（2.6）连接有目的单抗重链可变区(mVH)和轻链可变区(mVL)基因的表达载体共转染真核表达细胞株293；（2.7）收获的上清含有目的抗体，流式检测表达单抗与M435结合良好，阳性率达95%以上，表明已获得正确的抗体重链和轻链可变区序列。在本专利技术的一个优选实施例中，其中，步骤（2.6）中，所述真核表达细胞株293为悬浮培养，SFM4Transfx-293withoutL-glutamine(liquid)无血清培养基传代扩增，转染时用Gibco®FreeStyle™293ExpressionMedium无血清培养基替换；通过7天连续培养后收获上清，4000g离心30min，去除上清中细胞等杂质，并用0.45um滤器过滤除菌。为了实现本专利技术的目的之三，所采用的技术方案是：一种抗人B7-H3单克隆抗体的应用，其中，所述抗人B7-H3单克隆抗体用于制备用于肿瘤组织的免疫组化检测的试剂盒。为了实现本专利技术的目的之四，所采用的技术方案是：一种抗人B7-H3单克隆抗体的试剂盒，其中，所述试剂盒包含上述抗人B7-H3单克隆抗体。另外本专利技术还提供了一种抗人B7-H3单克隆抗体用于免疫组化检测组织标本，发现用该抗体B7-H3检测结直肠癌和胃癌组织标本，结果显示B7-H3在正常结直肠组织和胃炎组织基本不表达，瘤变阶段表达上调，在结直肠癌和胃癌高表达，且与病人的预后及生存相关。本专利技术的有益效果在于：本专利技术提供的抗人B7-H3单克隆抗体可以用于肿瘤组织的免疫组化检测，提高肿瘤标本免疫组化检测的精确度，有助于恶性肿瘤的诊断、确定原发部位和病理分型，提高肿瘤尤其是低分化或未分化肿瘤的诊断准确率。附图说明图1a为流式细胞术分析抗人B7-H3单抗4H12对L929/B7-H3表面B7-H3分子的阳性对照(positivecontrol)示意图。图1b为流式细胞术分析抗人B7-H3单抗4H12对L929/B7-H3表面B7-H3分子的实验组示意图。图2为B7-H3抗体用于免疫组化检测结直肠癌组织示意图。图3a为B7-H3在结直肠癌发生发展不同阶段异常表达示意图（1）。图3b为B7-H3在结直肠癌发生发展不同阶段异常表达示意图（2）。图4a为B7-H3单抗对浅表性胃炎、萎缩性胃炎、低级别瘤变、高级别瘤变和胃癌组织进行组化染色的结果示意图（1）。图4b为B7-H3单抗对浅表性胃炎、萎缩性胃炎、低级别瘤变、高级别瘤变和胃癌组织进行组化染色的结果示意图（2）。图5为对160例临床胃癌组织进行了B7-H3分子的免疫组化检测结本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种抗人B7‑H3单克隆抗体，包括重链和轻链，其特征在于，所述重链可变区(mVH)的氨基酸序列与SEQ ID NO.1相同，具体如下：EVQLVESGGGLVKPGGSLKLSCAASGFTFSRYAMSWVRQTPEKRLEWVATISDDGRNTYDRDSVKGRFTISRDNARNTLYLQMSSLRSEDTALYYCVRHRAITTARFDYWGQGTSLTVSS；所述轻链可变区(mVL)的氨基酸序列与SEQ ID NO.2相同，具体如下：DILMTQSPSSMSVSLGDTVSITCHASQDISSNIGWLQQGPGNSFKGLIYHGTNLEDGVPSRFSGSGSGADYSLTISGLESEDFADYYTLQSVQFPYTFGGGTKLEIK。

【技术特征摘要】
1.一种抗人B7-H3单克隆抗体，包括重链和轻链，其特征在于，所述重链可变区(mVH)的氨基酸序列与SEQIDNO.1相同，具体如下：EVQLVESGGGLVKPGGSLKLSCAASGFTFSRYAMSWVRQTPEKRLEWVATISDDGRNTYDRDSVKGRFTISRDNARNTLYLQMSSLRSEDTALYYCVRHRAITTARFDYWGQGTSLTVSS；所述轻链可变区(mVL)的氨基酸序列与SEQIDNO.2相同，具体如下：DILMTQSPSSMSVSLGDTVSITCHASQDISSNIGWLQQGPGNSFKGLIYHGTNLEDGVPSRFSGSGSGADYSLTISGLESEDFADYYTLQSVQFPYTFGGGTKLEIK。2.如权利要求1所述的一种抗人B7-H3单克隆抗体，其特征在于，所述所述重链可变区(mVH)具有三个高变区为：GFTFSRYA、ISDDGRNT、VRHRAITTARFDY。3.如权利要求1所述的一种抗人B7-H3单克隆抗体，其特征在于，所述轻链可变区(mVL)具有三个高变区为：QDISSN、HGT、LQSVQFPYT。4.如权利要求1-3任意一项所述的一种抗人B7-H3单克隆抗体在重链和轻链可变区的检测方法，其特征在于，包括如下步骤：（1）B7-H3单克隆抗体的杂交瘤的制备；（1.1）免疫小鼠；（1.2）细胞培养；（1.3）融合与筛选；（2）B7-H3鼠/人嵌合抗体的制备；（2.1）提取杂交瘤细胞的cDNA：从该杂交瘤细胞株中提取RNA，并使用RT-PCR技术，将获得的RNA反转录为cDNA；利用特定设计的上下游引物PCR克隆该杂交瘤细胞的重链可变区(mVH)和轻链可变区(mVL)；所述特定设计的上下游引物的序列分别为核苷酸SEQIDNO.3和核苷酸序列4；（2.2）所述重链可变区(mVH)和轻链可变区(mVL)分别与克隆载体(pJETcloningvector)连接...

【专利技术属性】
技术研发人员：张学光，
申请(专利权)人：苏州旭光科星生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏,32