蛋白水解可切割的嵌合多肽及其使用方法技术

本公开提供了嵌合多肽，所述嵌合多肽在所述多肽的特异性结合成员与其结合配偶体结合时诱导的切割事件后调节各种细胞过程。还提供了使用所述嵌合多肽调节细胞功能的方法，所述调节细胞功能包括例如诱导基因表达。提供了编码主题嵌合多肽的核酸及相关表达盒和载体以及含有此类核酸和/或表达盒和载体的细胞。还提供了使用所述组分和方法治疗受试者的方法以及用于实施主题方法的药盒。

Chimeric Peptides with Cuttable Protein Hydrolysis and Their Application

The present disclosure provides chimeric polypeptides that regulate various cellular processes after incision events induced by the binding of a specific binding member of the polypeptide to its binding partner. A method for regulating cell functions using the chimeric polypeptide, including, for example, inducing gene expression, is also provided. Nucleic acids encoding thematic chimeric polypeptides and related expression boxes and vectors, as well as cells containing such nucleic acids and/or expression boxes and vectors, are provided. A method for treating subjects using the components and methods and a medicine kit for implementing the subject method are also provided.

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】蛋白水解可切割的嵌合多肽及其使用方法交叉引用本申请要求2016年8月23日提交的美国临时专利申请第62/378,614号的权益，所述申请通过引用整体并入本文。关于联邦资助研究的声明本专利技术是在由美国国家卫生研究院颁发的第R01CA196277号拨款下借助政府资助进行的。政府对本专利技术拥有某些权利。通过引用作为文本文件提供的序列表的并入序列表在此以2017年8月22日创建的文本文件“UCSF-544WO_SeqList_ST25.txt”(其大小为365KB)提供。该文本文件的内容通过引用整体并入本文。引言常规地，通过使用驱动蛋白质表达的诱导型表达构建体实现对细胞行为和活性的控制，所述蛋白质在表达时改变细胞行为和/或活性。在研究环境中，诱导型表达系统极大地促进了我们对生命科学许多领域的理解，包括细胞生物学、分子生物学、遗传学、生物化学等。经过充分研究的诱导型细胞系统(例如，化学诱导型、光学诱导型等)通常全局影响细胞行为和活动和/或需要用户提供的输入来限制对群体的特定细胞的活性变化或控制系统例如，将系统在“开启”和“关闭”之间来回切换。最近，细胞工程提供了尝试重新编程细胞以检测其环境中的信号(例如，如由相邻细胞所提供的)的能力，并且将此类信号传输输入(signalinginput)自主地转换成期望的行为或活动输出的能力。
技术实现思路
本公开提供了嵌合多肽，所述嵌合多肽在该多肽的特异性结合成员与其结合配偶体结合时诱导的切割事件后调节各种细胞过程。还提供了使用嵌合多肽调节细胞功能(包括例如诱导基因表达)的方法。提供了编码主题嵌合多肽的核酸及相关表达盒和载体以及含有此类核酸和/或表达盒和载体的细胞。还提供了使用所述组分和方法治疗受试者的方法以及用于实施主题方法的药盒。本公开的方面包括嵌合多肽，其从N末端到C末端包含以下各项且以共价键联：a)细胞外结构域，其包含与肽-主要组织相容性复合物(肽-MHC)特异性结合的特异性结合成员；b)蛋白水解可切割的Notch受体多肽，其包含一个或多个蛋白水解切割位点；c)细胞内结构域，其包含转录激活因子或阻遏物，其中特异性结合成员与肽-MHC的结合诱导Notch受体多肽在一个或多个蛋白水解切割位点处的切割，从而释放细胞内结构域。在一些实施方案中，特异性结合成员包括抗体。在一些实施方案中，抗体是纳米抗体、双链抗体、三链抗体或微抗体、F(ab')2片段、Fab片段、单链可变片段(scFv)或单结构域抗体(sdAb)。在一些实施方案中，特异性结合成员特异性结合包含细胞内癌抗原肽的肽-MHC。在一些实施方案中，细胞内癌抗原肽是WT1肽或NY-ESO肽。在一些实施方案中，Notch受体多肽在其N末端包含一个或多个表皮生长因子(EGF)重复序列。在一些实施方案中，Notch受体多肽在其N末端包含2至11个EGF重复序列。在一些实施方案中，Notch受体多肽包含合成接头。在一些实施方案中，Notch受体多肽在一个或多个EGF重复序列与一个或多个蛋白水解切割位点之间包含合成接头。在一些实施方案中，Notch受体多肽具有50个氨基酸至1000个氨基酸的长度。在一些实施方案中，Notch受体多肽具有300个氨基酸至400个氨基酸的长度。在一些实施方案中，一个或多个蛋白水解切割位点包含S2蛋白水解切割位点、S3蛋白水解切割位点或其组合。在一些实施方案中，一个或多个蛋白水解切割位点包含S2蛋白水解切割位点，其为ADAM家族型蛋白酶切割位点，诸如例如包含Ala-Val二肽序列的ADAM-17型蛋白酶切割位点。在一些实施方案中，一个或多个蛋白水解切割位点包含S3蛋白水解切割位点，其为包含Gly-Val二肽序列的γ-分泌酶(γ-分泌酶)切割位点。在一些实施方案中，一个或多个蛋白水解切割位点还包含S1蛋白水解切割位点。在一些实施方案中，S1蛋白水解切割位点是弗林蛋白酶样蛋白酶切割位点，其包含氨基酸序列Arg-X-(Arg/Lys)-Arg(SEQIDNO:130)，其中X为任何氨基酸。在一些实施方案中，Notch受体多肽缺乏S1蛋白水解切割位点。在一些实施方案中，Notch受体多肽与图31A-32B中提供的序列具有至少85％氨基酸序列同一性。在一些实施方案中，Notch受体多肽与图31A中提供的序列或图31B中提供的序列具有至少85％氨基酸序列同一性。本公开的方面包括编码任何上述嵌合多肽的核酸。在一些实施方案中，核酸还包含响应于转录激活因子或阻遏物的转录控制元件，其与编码目标多肽(POI)的核酸序列可操作地连接。在一些实施方案中，POI是选自由以下组成的组的异源多肽：报告蛋白、嵌合抗原受体(CAR)、抗体、嵌合双特异性结合成员、工程化T细胞受体(TCR)和先天-免疫响应诱导剂。本公开的方面包括包含任何上述核酸的重组表达载体。本公开的方面包括诱导细胞中异源多肽表达的方法，所述方法包括：使细胞与肽-主要组织相容性复合物(肽-MHC)接触，其中所述细胞表达任何上述嵌合多肽并且包含编码异源多肽的序列，所述序列与响应于嵌合多肽的转录激活因子的转录控制元件可操作地连接，从而释放嵌合多肽的细胞内结构域并诱导异源多肽的表达。在一些实施方案中，异源多肽是报告蛋白、嵌合抗原受体(CAR)、抗体、嵌合双特异性结合成员、工程化T细胞受体(TCR)和先天-免疫响应诱导剂。本公开的方面包括宿主细胞，其包含：a)编码与第一种肽-主要组织相容性复合物(肽-MHC)特异性结合的任何上述嵌合多肽的核酸；和b)响应于嵌合多肽的转录激活因子的转录控制元件，其与编码目标多肽(POI)的核酸可操作地连接。在一些实施方案中，宿主细胞经遗传修饰，并且核酸和转录控制元件存在于宿主细胞的基因组内。在一些实施方案中，核酸和转录控制元件在宿主细胞内存在于染色体外。在一些实施方案中，POI是异源多肽。在一些实施方案中，异源多肽选自由以下组成的组：报告蛋白、嵌合抗原受体(CAR)、抗体、嵌合双特异性结合成员、工程化T细胞受体(TCR)和先天-免疫响应诱导剂。在一些实施方案中，异源多肽是与第二肽-MHC特异性结合的CAR。在一些实施方案中，嵌合多肽的特异性结合成员与包含第一细胞内癌抗原肽的第一肽-MHC特异性结合，并且CAR与包含第二细胞内癌抗原肽的第二肽-MHC特异性结合。在一些实施方案中，第一细胞内癌抗原肽是WT1肽，并且第二细胞内癌抗原肽是NY-ESO肽。在一些实施方案中，第一细胞内癌抗原肽是NY-ESO肽，并且第二细胞内癌抗原肽是WT1肽。在一些实施方案中，异源多肽是与第二肽-MHC特异性结合的工程化TAR。在一些实施方案中，嵌合多肽的特异性结合成员与包含第一细胞内癌抗原肽的第一肽-MHC特异性结合，并且工程化TCR与包含第二细胞内癌抗原肽的第二肽-MHC特异性结合。在一些实施方案中，第一细胞内癌抗原肽是WT1肽，并且第二细胞内癌抗原肽是NY-ESO肽。在一些实施方案中，第一细胞内癌抗原肽是NY-ESO肽，并且第二细胞内癌抗原肽是WT1肽。本公开的方面包括宿主细胞，其包含：a)编码嵌合多肽的核酸，所述嵌合多肽从N末端至C末端包含以下各项且以共价键联：i)细胞外结构域，其包含与存在于癌细胞表面上的靶分子特异性结合的特异性结合成员；ii)蛋白水解可切割的Notc本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种嵌合多肽，所述嵌合多肽从N末端至C末端包含以下各项且以共价键联：a)细胞外结构域，其包含与肽‑主要组织相容性复合物(肽‑MHC)特异性结合的特异性结合成员；b)蛋白水解可切割的Notch受体多肽，其包含一个或多个蛋白水解切割位点；和c)细胞内结构域，其包含转录激活因子，其中所述特异性结合成员与所述肽‑MHC的结合诱导所述Notch受体多肽在所述一个或多个蛋白水解切割位点处的切割，从而释放所述细胞内结构域。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2016.08.23 US 62/378,6141.一种嵌合多肽，所述嵌合多肽从N末端至C末端包含以下各项且以共价键联：a)细胞外结构域，其包含与肽-主要组织相容性复合物(肽-MHC)特异性结合的特异性结合成员；b)蛋白水解可切割的Notch受体多肽，其包含一个或多个蛋白水解切割位点；和c)细胞内结构域，其包含转录激活因子，其中所述特异性结合成员与所述肽-MHC的结合诱导所述Notch受体多肽在所述一个或多个蛋白水解切割位点处的切割，从而释放所述细胞内结构域。2.如权利要求1所述的嵌合多肽，其中所述特异性结合成员包括抗体。3.如权利要求2所述的嵌合多肽，其中所述抗体是纳米抗体、双链抗体、三链抗体或微抗体、F(ab')2片段、Fab片段、单链可变片段(scFv)或单结构域抗体(sdAb)。4.如前述权利要求中任一项所述的嵌合多肽，其中所述特异性结合成员特异性结合包含细胞内癌抗原肽的肽-MHC。5.如权利要求4所述的嵌合多肽，其中所述细胞内癌抗原肽是WT1肽或NY-ESO肽。6.如前述权利要求中任一项所述的嵌合多肽，其中所述Notch受体多肽在其N末端包含一个或多个表皮生长因子(EGF)重复序列。7.如权利要求6所述的嵌合多肽，其中所述Notch受体多肽在其N末端包含2至11个EGF重复序列。8.如前述权利要求中任一项所述的嵌合多肽，其中所述Notch受体多肽包含合成接头。9.如权利要求8所述的嵌合多肽，其中所述Notch受体多肽在所述一个或多个EGF重复序列与所述一个或多个蛋白水解切割位点之间包含合成接头。10.如前述权利要求中任一项所述的嵌合多肽，其中所述Notch受体多肽的长度为50个氨基酸至1000个氨基酸。11.如权利要求10所述的嵌合多肽，其中所述Notch受体多肽的长度为300个氨基酸至400个氨基酸。12.如前述权利要求中任一项所述的嵌合多肽，其中所述一个或多个蛋白水解切割位点包含S2蛋白水解切割位点、S3蛋白水解切割位点或其组合。13.如权利要求12所述的嵌合多肽，其中所述一个或多个蛋白水解切割位点包含S2蛋白水解切割位点，其为包含Ala-Val二肽序列的ADAM-17-型蛋白酶切割位点。14.如前述权利要求中任一项所述的嵌合多肽，其中所述一个或多个蛋白水解切割位点包含S3蛋白水解切割位点，其为包含Gly-Val二肽序列的γ-分泌酶(γ-分泌酶)切割位点。15.如前述权利要求中任一项所述的嵌合多肽，其中所述一个或多个蛋白水解切割位点还包含S1蛋白水解切割位点。16.如权利要求15所述的嵌合多肽，其中所述S1蛋白水解切割位点是弗林蛋白酶样蛋白酶切割位点，其包含氨基酸序列Arg-X-(Arg/Lys)-Arg(SEQIDNO:130)，其中X为任何氨基酸。17.如前述权利要求中任一项所述的嵌合多肽，其中所述Notch受体多肽缺乏S1蛋白水解切割位点。18.如前述权利要求中任一项所述的嵌合多肽，其中所述Notch受体多肽与图31A-32B中提供的序列具有至少85％氨基酸序列同一性。19.如权利要求18所述的嵌合多肽，其中所述Notch受体多肽与图31A中提供的序列或图31B中提供的序列具有至少85％氨基酸序列同一性。20.一种核酸，所述核酸编码根据权利要求1-19中任一项所述的嵌合多肽。21.如权利要求20所述的核酸，其中所述核酸还包含响应于转录激活因子的转录控制元件，所述转录控制元件与编码目标多肽(POI)的核酸序列可操作地连接。22.如权利要求21所述的核酸，其中所述POI是选自由以下组成的组的异源多肽：报告蛋白、嵌合抗原受体(CAR)、抗体、嵌合双特异性结合成员、工程化T细胞受体(TCR)和先天-免疫响应诱导剂。23.一种重组表达载体，所述重组表达载体包含根据权利要求20-22中任一项所述的核酸。24.一种诱导细胞中异源多肽表达的方法，所述方法包括：使细胞与肽-主要组织相容性复合物(肽-MHC)接触，其中所述细胞表达根据权利要求1-19中任一项所述的嵌合多肽并且包含编码所述异源多肽的序列，所述编码所述异源多肽的序列与响应于所述嵌合多肽的转录激活因子的转录控制元件可操作地连接，从而释放所述嵌合多肽的细胞内结构域并诱导所述异源多肽的表达。25.如权利要求24所述的方法，其中所述异源多肽是报告蛋白、嵌合抗原受体(CAR)、抗体、嵌合双特异性结合成员、工程化T细胞受体(TCR)和先天-免疫响应诱导剂。26.一种宿主细胞，所述宿主细胞包含：a)根据权利要求20-22中任一项所述的编码嵌合多肽的核酸，所述嵌合多肽与第一肽-主要组织相容性复合物(肽-MHC)特异性结合；和b)响应于所述嵌合多肽的转录激活因子的转录控制元件，所述转录控制元件与编码目标多肽(POI)的核酸序列可操作地连接。27.如权利要求26所述的宿主细胞，其中所述宿主细胞被遗传修饰，并且所述核酸和所述转录控制元件存在于所述宿主细胞的基因组内。28.如权利要求26所述的宿主细胞，其中所述核酸和所述转录控制元件在所述宿主细胞内存在于染色体外。29.如权利要求26-28中任一项所述的宿主细胞，其中所述POI是异源多肽。30.如权利要求29所述的宿主细胞，其中所述异源多肽选自由以下组成的组：报告蛋白、嵌合抗原受体(CAR)、抗体、嵌合双特异性结合成员、工程化T细胞受体(TCR)和先天-免疫响应诱导剂。31.如权利要求30所述的宿主细胞，其中所述异源多肽是与第二肽-MHC特异性结合的CAR。32.如权利要求31所述的宿主细胞，其中所述嵌合多肽的特异性结合成员与包含第一细胞内癌抗原肽的第一肽-MHC特异性结合，并且所述CAR与包含第二细胞内癌抗原肽的第二肽-MHC特异性结合。33.如权利要求32所述的宿主细胞，其中所述第一细胞内癌抗原肽是WT1肽，并且所述第二细胞内癌抗原肽是NY-ESO肽。34.如权利要求32所述的宿主细胞，其中所述第一细胞内癌抗原肽是NY-ESO肽，并且所述第二细胞内癌抗原肽是WT1肽。35.如权利要求30所述的宿主细胞，其中所述异源多肽是与第二肽-MHC特异性结合的工程化TCR。36.如权利要求35所述的宿主细胞，其中所述嵌合多肽的特异性结合成员与包含第一细胞内癌抗原肽的第一肽-MHC特异性结合，并且所述工程化TCR与包含第二细胞内癌抗原肽的第二肽-MHC特异性结合。37.如权利要求36所述的宿主细胞，其中所述第一细胞内癌抗原肽是WT1肽，并且所述第二细胞内癌抗原肽是NY-ESO肽。38.如权利要求36所述的宿主细胞，其中所述第一细胞内癌抗原肽是NY-ESO肽，并且所述第二细胞内癌抗原肽是WT1肽。39.一种宿主细胞，所述宿主细胞包含：a)编码嵌合多肽的核酸，所述嵌合多肽从N末端至C末端包含以下各项且以共价键联：i)细胞外结构域，其包含与存在于癌细胞表面上的靶分子特异性结合的特异性结合成员；ii)蛋白水解可切割的Notch受体多肽，其包含一个或多个蛋白水解切割位点；和iii)细胞内结构域，其包含转录激活因子；b)编码嵌合双特异性结合成员的核酸，其与响应于所述转录激活因子的转录控制元件可操作地连接，其中所述特异性结合成员与所述靶分子的结合诱导所述Notch受体多肽在所述一个或多个蛋白水解切割位点处的切割，从而释放所述细胞内结构域，激活所述转录控制元件并使所述嵌合双特异性结合成员表达。40.根据权利要求39所述的宿主细胞，其中所述嵌合双特异性结合成员包含对癌抗原有特异性的结合结构域和对免疫细胞表面上表达的蛋白有特异性的结合结构域。41.根据权利要求39或40所述的宿主细胞，其中所述嵌合双特异性结合成员包含至少一个抗体源性抗原结合结构域。42.根据权利要求41所述的宿主细胞，其中所述嵌合双特异...

【专利技术属性】
技术研发人员：W·A·林，K·T·罗伊鲍尔，J·Z·威廉姆斯，
申请(专利权)人：加利福尼亚大学董事会，
类型：发明
国别省市：美国,US