【技术实现步骤摘要】
技术介绍
1、二千六百万美国人患有器官损伤，例如与慢性肾病(ckd)，以及器官移植排斥和功能障碍，例如肾移植或肺移植相关的器官损伤。治疗这些损伤是非常昂贵的。例如，每年医疗保险支出的28％(575亿美元)用于治疗ckd。然而，对于其中许多人来说，没有办法在临床症状出现之前预测损伤何时即将发生。与这些疾病相关的大部分成本是由于缺乏早期检测导致更严重的器官损伤所致并且需要更多和更昂贵的治疗干预。早期检测肾病的方法可以降低医疗费用和更有效的治疗干预。
2、传统上，器官损伤(例如肾损伤)的检测基于对活检物的检查，其既昂贵又具有侵入性。最近，在人尿液中发现了来自垂死细胞的无细胞dna(cfdna)。最近的努力集中在测试尿液的cfdna作为同种异体移植物排斥而不是器官损伤的标志物；此外，该技术仅限于使用pcr或下一代测序来检测供体特异性snp或测量alu元件。这些方法具有局限性，因为它们仅限于测试肾脏排斥，在消耗品和设备上都是昂贵的，需要相对较大量的dna，并且不是高通量的。此外，它们可能无法检测到短于150bp的片段长度，因为已发现尽管整个未片段化的dna对于基于qpcr的alu测量方法是最佳的，但片段大小＜150bp的dna在dna定量中显著减少(减少75％)(sedlackova等，biol.proced.online(2013)15：5.doi：10.1186/1480-9222-15-5)。
技术实现思路
1、提供了一种用于定量分析生物流体，例如尿液和支气管肺泡灌洗液(
2、在一个方面，本公开内容提供了溶液，例如无菌溶液，其包含浓度足以抑制细胞裂解和抑制尿液中核酸酶的甲醛供体，螯合剂，金精三羧酸和聚乙二醇(peg)。在一些实施方式中，溶液还包含叠氮化钠和/或缓冲剂。在一些实施方式中，溶液还包含生物流体样品。在一些实施方式中，生物流体样品是尿液样品或bal样品，作为用于肾脏或肺器官损伤的非侵入性测量的选择的流出物。在一些实施方式中，尿液样品来自已经接受肾移植或具有急性或慢性肾损伤的患者，在其他实施方式中，其是来自已经接受肺移植或具有肺损伤的患者的支气管肺泡灌洗液(bal)。
3、在一个方面，本公开内容提供了检测生物流体样品中的alu拷贝数的方法，该方法包括：从人体获得尿液或其他生物流体样品，从样品中提取cfdna，通过使cfdna与核酸探针在允许探针与与探针互补的cfdna中的dna杂交的条件下接触形成反应混合物，其中核酸探针具有有3′和5′末端的核酸序列，其中核酸探针与seq id no：1的连续20-292个核苷酸互补，其中3′或5′末端与可检测标记物共价连接；并定量与探针杂交的dna的量。在一些实施方式中，探针与seq id no：2的至少50个连续核苷酸互补。在一些实施方式中，探针包含与seq id no：1互补的50-150、70-100、80-90或恰好81个核苷酸的序列。在一些实施方式中，可检测标记物是生物素，并且该方法包括使可检测标记物与链霉亲和素连接的信号产生剂接触。
4、在一些实施方式中，在形成反应混合物之前，将包含二偶氮烷基脲，edta，金精三羧酸和聚乙二醇(peg)的溶液以足以抑制细胞裂解和抑制核酸酶的浓度混合到尿液样品中。在一些实施方式中，该方法还包括定量反应混合物中肌酸酐的量。在一些实施方式中，该方法还包括将与探针杂交的cfdna的量相对于尿液样品中肌酸酐的量标准化，以产生cfdna的标准化量。在一些实施方式中，该方法还包括将与探针杂交的cfdna的量相对于尿液样品中肌酸酐的量标准化，以产生杂交的dna的标准化量。在一些实施方式中，该方法还包括如果检测到的与探针杂交的靶dna(例如cfdna)的量或靶dna(例如cfdna)的标准化量大于截止值，则确定患者具有肾损伤。
5、在一些实施方式中，人是已经接受肾或肺移植的患者，并且肾或肺损伤的存在表明患者可能有急性排斥反应发作。在一些实施方式中，该方法还包括基于靶dna(例如cfdna)的标准化量和肾移植后的时间产生用于确定肾或肺健康的预测评分。当预测评分大于预测评分的截止值时，确定患者有急性排斥反应发作。在一些实施方式中，尿液或bal样品在患者接受肾脏或肺移植后0-400天，或10-100天，或20-50天获取。
6、在一些实施方式中，尿液样品来自疑似患有由选自下组的疾病引起的肾损伤的个体：bk病毒性肾炎，局灶性节段性肾小球硬化(fsgs)，肾结石，急性肾小管坏死(atn)，iga肾病(igan)，和糖尿病肾病，或来自全身性疾病，如高血压和自身免疫性疾病(如sly，类风湿性关节炎)的肾病。在这些实施方式中，肾损伤的确定表明患者患有该疾病。
7、在一些实施方式中，该方法还包括通过添加反映炎性负荷的生物标志物来量化反应混合物中cxcl10的量以增加对测定的更高特异度和灵敏度。在一些实施方式中，该方法还包括定量甲基化的cfdna和羟甲基化的cfdna的比例或绝对量，以反映循环dna的甲基化状态，其进一步定义了内在组织损伤的存在。
8、另一方面，本专利技术提供了一种反应混合物，其包含从尿液样品中提取的非扩增的无细胞dna(cfdna)(例如，在一些实施方式中，来自已经接受肾移植的患者)和ii)核酸探针，其具有核酸序列并具有3′和5′末端，其中核酸探针与seq id no：1的20-292个连续核苷酸互补，并且其中3′或5′末端与可检测标记物共价连接。反应混合物可包含本文所述的任何组分。
9、另一方面，本文提供了检测来自具有肺移植或肺移植临床病症的个体的生物流体样品中无细胞dna(cfdna)中的alu拷贝数的方法。该方法包括从人体获得生物流体样品，例如支气管肺泡灌洗液(bal)流体样品；从生物流体样品中提取cfdna；通过使cfdna与核酸探针在允许探针与与探针互补的cfdna中的dna杂交的条件下接触以形成反应混合物，其中核酸探针具有有3′和5′末端的核酸序列，其中核酸探针与seq id no：1的连续20-292个核苷酸互补，并且其中3′或5′末端是共价连接的可检测标记物；并定量与探针杂交的dna量，从而检测生物流体样品中无细胞dna(cfdna)中的alu拷贝数。在一些实施方式中，生物流体样品是支气管肺泡灌洗(bal)流体样品，并且其中该方法还包括定量bal流体的总体积。
10、在一些实施方式中，该方法还包括相对于总bal流体样品体积标准化与探针杂交的c本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种反应混合物，其包含：
2.如权利要求1所述的反应混合物，其中所述可检测部分是荧光分子。
3.如权利要求1所述的反应混合物，其中所述可检测部分是生物素。
4.如权利要求3所述的反应混合物，其中所述反应混合物还包含链霉亲和素连接的信号产生剂。
5.如权利要求4所述的反应混合物，其中所述链霉亲和素连接的信号产生剂产生化学发光、颜色或荧光。
6.如权利要求1所述的反应混合物，其中所述可检测部分是荧光素或地高辛(DIG)。
7.如权利要求6所述的反应混合物，其中所述荧光素或地高辛(DIG)偶联至辣根过氧化物酶(HRP)。
8.如权利要求1所述的反应混合物，其中所述核酸探针的3′末端或5′末端与至少2个可检测部分共价连接。
9.如权利要求1所述的反应混合物，其中所述核酸探针的3′末端和5′末端与至少2个可检测部分共价连接。
10.如权利要求1所述的反应混合物，其中所述核酸探针的3′末端或5′末端与至少3个可检测部分共价连接。
11.如权利要求1所述的反应混合物，其中
12.如权利要求1所述的反应混合物，其中所述核酸探针与SEQ ID NO：1的81个核苷酸互补。
13.如权利要求1所述的反应混合物，其中所述核酸探针与SEQ ID NO：1的至少70-290个核苷酸互补。
14.如权利要求1所述的反应混合物，其中所述核酸探针与SEQ ID NO：1的至少70-180个连续核苷酸互补。
15.如权利要求1所述的反应混合物，其中所述核酸探针与SEQ ID NO：1的至少70-150个连续核苷酸互补。
16.如权利要求1所述的反应混合物，其中所述核酸探针与SEQ ID NO：1的至少70-100个连续核苷酸互补。
17.如权利要求1所述的反应混合物，其中所述核酸探针与SEQ ID NO：1的至少80-90个连续核苷酸互补。
18.如权利要求1所述的反应混合物，其中所述尿液样品来自已经接受肾移植的人。
19.如权利要求18所述的反应混合物，其中所述尿液样品在人接受肾移植后0-400天，或10-100天，或20-50天获取。
20.如权利要求18所述的反应混合物，其中所述尿液样品在人接受肾移植后人的寿命期间获取。
21.一种检测尿液样品中无细胞DNA(cfDNA)中的Alu拷贝数的方法，所述方法包括：
...【技术特征摘要】
1.一种反应混合物，其包含：
2.如权利要求1所述的反应混合物，其中所述可检测部分是荧光分子。
3.如权利要求1所述的反应混合物，其中所述可检测部分是生物素。
4.如权利要求3所述的反应混合物，其中所述反应混合物还包含链霉亲和素连接的信号产生剂。
5.如权利要求4所述的反应混合物，其中所述链霉亲和素连接的信号产生剂产生化学发光、颜色或荧光。
6.如权利要求1所述的反应混合物，其中所述可检测部分是荧光素或地高辛(dig)。
7.如权利要求6所述的反应混合物，其中所述荧光素或地高辛(dig)偶联至辣根过氧化物酶(hrp)。
8.如权利要求1所述的反应混合物，其中所述核酸探针的3′末端或5′末端与至少2个可检测部分共价连接。
9.如权利要求1所述的反应混合物，其中所述核酸探针的3′末端和5′末端与至少2个可检测部分共价连接。
10.如权利要求1所述的反应混合物，其中所述核酸探针的3′末端或5′末端与至少3个可检测部分共价连接。
11.如权利要求1所述的反应混合物，其中所述核酸探针的3′末端和5′末端与至少3个可检测部分共价连接。
12.如权利要求1所述的反应混合物，其中...
【专利技术属性】
技术研发人员：M·M·萨尔沃，T·K·西格德尔，杨心民，
申请(专利权)人：加利福尼亚大学董事会，
类型：发明
国别省市：
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。