抗人B7-H1单克隆抗体制备方法及其在免疫组化检测应用技术

本发明专利技术公开了一种抗人B7‑H1（PD‑L1）单克隆抗体及其免疫组化的检测应用和抗体重链、轻链可变区序列的鉴定，本发明专利技术涉及抗人B7‑H1单克隆抗体的制备以及这株单克隆抗体可用于免疫组化标本检测及肿瘤组织B7‑H1分析，并从分泌抗人B7‑H1单克隆抗体的杂交瘤细胞中提取重链可变区(mVH)和轻链可变区(mVL)，测序验证B7‑H1重轻链可变序列。在此基础上实施真核细胞株表达抗体，所获抗体经验证具有良好的结合能力，采用免疫组织化学检测对肿瘤标本特异性染色，并比较自行研制的B7‑H1单抗与商品化B7‑H1抗体对同一组织标本染色的效果和特异性。

【技术实现步骤摘要】
抗人B7-H1单克隆抗体制备方法及其在免疫组化检测应用
本专利技术涉及一种抗体免疫组化的检测应用，以及抗体重链可变区和轻链可变区序列的验证，属于生物
，特别涉及抗人B7-H1单克隆抗体的制备方法及其在免疫组化检测的应用。
技术介绍
肿瘤微环境是肿瘤细胞和宿主免疫系统相互作用的重要位置。深入了解微环境中免疫细胞及肿瘤免疫的机制是提高机体肿瘤免疫力，建立有效的癌症免疫治疗手段的关键。肿瘤细胞与人体免疫系统形成的微环境促进了肿瘤免疫逃逸，最终导致肿瘤复发和转移。一组参与下调和中止免疫应答的负性共刺激分子，包括PD-1、B7-H1(PD-L1)、B7-H3和B7-H4等，又称为免疫卡控点，异常表达在肿瘤发展的不同阶段，导致机体抗肿瘤免疫力下降，促进肿瘤生长和转移，其中负性B7家族的B7-H1被最早发现和鉴定，B7-H1（PD-L1）属于B7家族的第4个成员，人B7-H1是编码290个氨基酸的Ⅰ型跨膜蛋白，在蛋白结构上包含IgV样区、IgC样区、跨膜区和一个短而保守的胞浆区。B7-H1的mRNA主要表达于胎盘、心脏（鼠中表达较低）、肝脏、肺、肾、骨骼肌和少数造血组织等非淋巴组织，一些未成熟谱系标记阴性和c-Kit阳性的骨髓造血细胞以及白血病细胞系也有B7-H1mRNA的表达；胸腺组织有高水平B7-H1mRNA的表达，但在淋巴结和脾脏等淋巴组织的表达量却甚微。蛋白水平上，B7-H1广泛组成性表达于多种实质器官组织、免疫细胞以及多种类型的肿瘤细胞上，如诱导性表达在活化的T、B、单核细胞和肿瘤细胞（如：肺癌、肝癌、乳腺癌、鳞状细胞癌及卵巢癌等）。大量的研究表明，B7-H1与活化的T细胞上PD-1相互作用可显著抑制效应性T细胞的生物学功能。迄今为止，FDA已批准了靶向PD-1/PD-L1的治疗性抗体用于治疗转移性黑色素瘤，非小细胞肺癌，肾细胞癌和膀胱上皮癌等。然而，在晚期转移性黑色素瘤中，PD-1药物临床应用的有效性受到了很大的阻碍。Keytruda和Opdivo作为最早获得FDA批准上市的PD-1抗体药物，Keytruda一线单药治疗PD-L1高表达（PD-L1≥50%）的晚期NSCLC，无论是PFS还是OS均优于标准化疗组，III期研究到达了主要终点而提前结束；Opdivo一线单药治疗PD-L1阳性表达（PD-L1≥5%）晚期NSCLC的III期研究则未能到达PFS的主要终点。临床试验结果给卡控点免疫治疗提出了新问题：患者用药前需要检测PD-1、PD-L1的表达以及确定表达水平的评价标准。针对肺癌、恶性黑色素瘤和胃癌的几项临床试验数据结果显示，随着患者PD-L1表达水平的提高，PD-1药物应答率、无进展生存期和中位生存期有明显提高，提示我们PD-L1伴随诊断在指导肿瘤免疫治疗的抗体用药、提高肿瘤病理检测和预后评估的准确度方面扮演着不可或缺的重要角色，PD-1治疗性单抗以及PD-L1伴随诊断试剂的共同研发是今后免疫卡控点靶向治疗的必然趋势。FDA批准的28种伴随诊断(CompanionDiagnostics,CDx)产品中，PD-L1单抗用于定性免疫组织化学分析，检测结果将为肿瘤治疗诊断提供参考。由此表明PD-L1表达水平和临床受益存在一定的相关性，肿瘤患者在接受PD-1单抗药物治疗前有必要进行PD-L1分子的检测。目前国内尚无灵敏度高、特异性好并能与FDA批准的两种PD-L1伴随抗体具有同样检测效果的诊断试剂，研制PD-L1组化检测试剂对于判断靶向PD-1的治疗方案是否适用和预测患者针对特定药物的治疗效果至关重要。
技术实现思路
本专利技术的目的之一是提供一种抗人B7-H1单克隆抗体。本专利技术的目的之二是提供一种抗人B7-H1抗体重链和轻链可变区的鉴定。本专利技术从分泌抗人B7-H1单克隆抗体的杂交瘤细胞中提取重链可变区(mVH)和轻链可变区(mVL)，根据测序结果保留候选的重轻链可变区序列，PCR扩增出与表达载体匹配的重链、轻链可变区序列，将PCR产物与双酶切预先处理的线性表达载体连接，连接产物转化感受态细菌DH5a。连接有目的单抗重链和轻链可变区基因的表达载体共转染真核表达细胞株293，培养收获的上清含有目的抗体，证明得到的重链和轻链可变区序列正确；本专利技术的目的之三是提供一种抗人B7-H1单克隆抗体用于免疫组化检测组织标本，发现用该抗体B7-H1对扁桃体组织进行组化染色，其淋巴滤泡周围呈阳性表达；进一步用于免疫组化的病理标本检测，结果显示B7-H1在肠癌病人间质细胞的胞浆和细胞核及肠癌细胞的胞膜呈高表达。为了实现上述目的，本专利技术的技术方案如下：作为本专利技术的第一方面一种抗人B7-H1单克隆抗体，包括重链和轻链，其特征在于，所述重链可变区(mVH)的氨基酸序列与SEQIDNO.1相同，具体如下：EVQLVESGGDLVKPGGSLKLSCAASGFTFSYYAMSWVRQTPEKRLEWVASISSRGDTYYPDIVKGRFTISRDNARNILYLQMRSLRSEDTALYYCARGGGNYEGLDYWGQGTSFTVSS；所述轻链可变区(mVL)的氨基酸序列与SEQIDNO.2相同，具体如下：QIVLTQSPAIMSASPGEKVTMTCSVSSSITFMYWFQQKPGSSPRLLIYDTSKLASGVPVRFSGSGSGTSYSLTISRMEAEDAATYYCQQWSGYPYTFGGGTKLEIK。在本专利技术的一个优选实施例中，所述所述重链可变区(mVH)具有三个高变区为：GFTFSYYA、ISSRGDT、AARGGGNYEGLDY。在本专利技术的一个优选实施例中，所述轻链可变区(mVL)具有三个高变区为：SSVGY、ATS、QQWSSNPPT。作为本专利技术的第二方面的一种抗人B7-H1抗体重链和轻链可变区序列的鉴定，其特征在于，包括以下步骤：（1）B7-H1单克隆抗体的杂交瘤的制备；（1.1）免疫小鼠；（1.2）细胞培养；（1.3）融合与筛选；（2）B7-H1鼠/人嵌合抗体的制备；（2.1）提取杂交瘤细胞的cDNA：从该杂交瘤细胞株中提取RNA，并使用RT-PCR技术，将获得的RNA反转录为cDNA；利用特定设计的上下游引物PCR克隆该杂交瘤细胞的重链可变区(mVH)和轻链可变区(mVL)；所述特定设计的上下游引物的序列分别为核苷酸SEQIDNO.3和核苷酸序列4；（2.2）所述重链可变区(mVH)和轻链可变区(mVL)分别与克隆载体(pJETcloningvector)连接，连接产物转化感受态细菌DH5a，由于pJET载体带有氨苄(Amp+)抗性基因，可将转化菌液涂在Amp抗性的LB固体培养基上，37°过夜培养；（2.3）待涂板细菌长出分散菌落，选择边缘清晰、生长良好的菌落，进一步测序鉴定；（2.4）根据测序结果保留候选的重链可变区(mVH)和轻链可变区(mVL)序列，再次PCR扩增出与表达载体匹配的重链可变区(mVH)和轻链可变区(mVL)序列，将PCR产物与双酶切预先处理的线性表达载体连接，连接产物转化感受态细菌DH5a，由于表达载体带有卡那霉素(Kana+)抗性基因，可将转化菌液涂在Kana抗性的LB固体培养基上，37°过夜培养；（2.5）测序方法参照（2.4）对比两次测序结果，挑选正确序列的转化菌，本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种抗人B7‑H1单克隆抗体，包括重链和轻链，其特征在于，所述重链可变区(mVH)的氨基酸序列与SEQ ID NO.1相同，具体如下：EVQLVESGGDLVKPGGSLKLSCAASGFTFSYYAMSWVRQTPEKRLEWVASISSRGDTYYPDIVKGRFTISRDNARNILYLQMRSLRSEDTALYYCARGGGNYEGLDYWGQGTSFTVSS；所述轻链可变区(mVL)的氨基酸序列与SEQ ID NO.2相同，具体如下：QIVLTQSPAIMSASPGEKVTMTCSVSSSITFMYWFQQKPGSSPRLLIYDTSKLASGVPVRFSGSGSGTSYSLTISRMEAEDAATYYCQQWSGYPYTFGGGTKLEIK。

【技术特征摘要】
1.一种抗人B7-H1单克隆抗体，包括重链和轻链，其特征在于，所述重链可变区(mVH)的氨基酸序列与SEQIDNO.1相同，具体如下：EVQLVESGGDLVKPGGSLKLSCAASGFTFSYYAMSWVRQTPEKRLEWVASISSRGDTYYPDIVKGRFTISRDNARNILYLQMRSLRSEDTALYYCARGGGNYEGLDYWGQGTSFTVSS；所述轻链可变区(mVL)的氨基酸序列与SEQIDNO.2相同，具体如下：QIVLTQSPAIMSASPGEKVTMTCSVSSSITFMYWFQQKPGSSPRLLIYDTSKLASGVPVRFSGSGSGTSYSLTISRMEAEDAATYYCQQWSGYPYTFGGGTKLEIK。2.如权利要求1所述的一种抗人B7-H1单克隆抗体，其特征在于，所述所述重链可变区(mVH)具有三个高变区为：GFTFSYYA、ISSRGDT、AARGGGNYEGLDY。3.如权利要求1所述的一种抗人B7-H1单克隆抗体，其特征在于，所述轻链可变区(mVL)具有三个高变区为：SSVGY、ATS、QQWSSNPPT。4.权利要求1至3任一项权利要求所述的一种抗人B7-H1单克隆抗体的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：（1）B7-H1单克隆抗体的杂交瘤的制备；（1.1）免疫小鼠；（1.2）细胞培养；（1.3）融合与筛选；（2）B7-H1鼠/人嵌合抗体的制备；（2.1）提取杂交瘤细胞的cDNA：从该杂交瘤细胞株中提取RNA，并使用RT-PCR技术，将获得的RNA反转录为cDNA；利用特定设计的上下游引物PCR克隆该杂交瘤细胞的重链可变区(mVH)和轻链可变区(mVL)；所述特定设计的上下游引物的序列分别为核苷酸SEQIDNO.3和核苷酸序列4；（2.2）所述重链可变区(mVH)和轻链可变区(mVL)分别与克隆载体(pJET...

【专利技术属性】
技术研发人员：张学光，
申请(专利权)人：苏州旭光科星生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏,32