抗人B7-H4单克隆抗体、鉴定方法、应用和试剂盒技术

本发明专利技术公开了一种抗人B7‑H4单克隆抗体、抗人B7‑H4单克隆抗体、鉴定方法、应用和试剂盒，本发明专利技术的抗人B7‑H4单克隆抗体以及这株单克隆抗体可用于免疫组化标本检测及肿瘤组织B7‑H4表达分析，并从分泌抗人B7‑H4单克隆抗体的杂交瘤细胞中提取重链可变区(mVH)和轻链可变区(mVL)，测序验证B7‑H4重轻链可变序列。在此基础上实施真核细胞株表达抗体，所获抗体经验证具有良好的结合能力，采用免疫组织化学检测对肿瘤标本特异性染色，并比较自行研制的B7‑H4单抗与商品化B7‑H4抗体对同一组织标本染色的效果和特异性。

【技术实现步骤摘要】
抗人B7-H4单克隆抗体、鉴定方法、应用和试剂盒
本专利技术涉及一种抗体免疫组化的检测应用，以及抗体重链可变区和轻链可变区序列的验证，属于生物
，特别涉及抗人B7-H4单克隆抗体、鉴定方法、应用和试剂盒。
技术介绍
近年来，越来越多的研究发现，B7-H4分子异常表达在各种肿瘤组织，如卵巢癌、乳腺癌、肺癌、肾癌、结直肠癌、前列腺癌等。临床回顾性病例分析发现，B7-H4的表达与临床病理学特征存在相关性，通过生存分析发现高表达B7-H4的病例预后差，死亡率高，并且在肿瘤患者外周血中也发现了高水平的可溶性B7-H4（sB7-H4）。此外，研究还发现，B7-H4与移植免疫排斥和自身免疫病理相关，转染了B7-H4基因的移植物可以抑制宿主T细胞的活性，从而延长移植物的生存时间。这些研究结果都提示，B7-H4是个重要的负性共刺激分子，具有重要的研究和运用价值。人类很多肿瘤中，B7-H4在mRNA和蛋白水平上均有表达并且与病人的预后呈负相关。B7-H4异常表达于肿瘤组织或肿瘤患者的外周血中，并和年龄、病理类型、肿瘤生物学效应和患者生存率密切相关，因此，研制鼠抗人B7-H4单克隆抗体可以为进一步研究该分子在肿瘤中的作用奠定物质基础，同时也为探明B7-H4信号传导通路及机制提供有效的研究手段，有功能的抗人B7-H4单克隆抗体更有望成为肿瘤生物治疗的潜在靶点。
技术实现思路
本专利技术的目的之一是提供一种抗人B7-H4单克隆抗体；本专利技术的目的之二是提供一种抗人B7-H4抗体重链和轻链可变区序列的鉴定方法。本专利技术从分泌抗人B7-H4单克隆抗体的杂交瘤细胞中提取重链可变区(mVH)和轻链可变区(mVL)，根据测序结果保留候选的重轻链可变区序列，PCR扩增出与表达载体匹配的重链、轻链可变区序列，将PCR产物与双酶切预先处理的线性表达载体连接，连接产物转化感受态细菌DH5a。连接有目的单抗重链和轻链可变区基因的表达载体共转染真核表达细胞株293，培养收获的上清含有目的抗体，证明得到的重链和轻链可变区序列正确；本专利技术的目的之三是提供一种抗人B7-H4单克隆抗体用于免疫组化检测组织标本，发现用该抗体B7-H4对肝癌组织标本组织进行组化染色，胞膜和胞浆均有明显着色；进一步用于免疫组化的病理标本检测，结果显示B7-H4在肠癌病人间质细胞的胞浆和细胞核及肠癌细胞的胞膜呈高表达。本专利技术的目的之四是提供一种利用上述抗人B7-H4单克隆抗体制备的试剂盒。为了实现上述目的，本专利技术的技术方案如下：作为本专利技术的第一方面一种抗人B7-H4单克隆抗体，包括重链和轻链，其特征在于，所述重链可变区(mVH)的氨基酸序列与SEQIDNO.1相同，具体如下：DVQLQESGPGLVKPSQSLSLTCTVTGYSITSDFAWNWIRQFPGNKLDWMGYISYSGDTNYNPSLKSRISITRDTSKNQFFLQLNSVTTEDTATYYCARDYGSGAWYFDVWGAGTTVTVSS；所述轻链可变区(mVL)的氨基酸序列与SEQIDNO.2相同，具体如下：DIVMTQSPSSLAVSVGEKVTMSCKSSQSLLNSRTRKNYLAWYQQKPGQSPKLLIYWASTRESGVPDRFTGSGSGTDFILTISSVQAEDLAVYYCKQSYNLWTFGGGTKLEIK。在本专利技术的一个优选实施例中，所述重链可变区(mVH)具有三个高变区为：GYSITSDFA、ISYSGDT、ARDYGSGAWYFDV。在本专利技术的一个优选实施例中，所述轻链可变区(mVL)具有三个高变区为：QSLLNSRTRKNY、WAS、KQSYNLWT。作为本专利技术的第二方面的一种抗人B7-H4抗体重链和轻链可变区序列的鉴定方法，其特征在于，包括以下步骤：（1）B7-H4单克隆抗体的杂交瘤的制备；（1.1）免疫小鼠；（1.2）细胞培养；（1.3）融合与筛选；（2）B7-H4鼠/人嵌合抗体的制备；（2.1）提取杂交瘤细胞的cDNA：从该杂交瘤细胞株中提取RNA，并使用RT-PCR技术，将获得的RNA反转录为cDNA；利用特定设计的上下游引物PCR克隆该杂交瘤细胞的重链可变区(mVH)和轻链可变区(mVL)；所述特定设计的上下游引物的序列分别为核苷酸SEQIDNO.3和核苷酸序列4；（2.2）所述重链可变区(mVH)和轻链可变区(mVL)分别与克隆载体(pJETcloningvector)连接，连接产物转化感受态细菌DH5a，由于pJET载体带有氨苄(Amp+)抗性基因，可将转化菌液涂在Amp抗性的LB固体培养基上，37°过夜培养；（2.3）待涂板细菌长出分散菌落，选择边缘清晰、生长良好的菌落，进一步测序鉴定；（2.4）根据测序结果保留候选的重链可变区(mVH)和轻链可变区(mVL)序列，再次PCR扩增出与表达载体匹配的重链可变区(mVH)和轻链可变区(mVL)序列，将PCR产物与双酶切预先处理的线性表达载体连接，连接产物转化感受态细菌DH5a，由于表达载体带有卡那霉素(Kana+)抗性基因，可将转化菌液涂在Kana抗性的LB固体培养基上，37°过夜培养；（2.5）测序方法参照（2.4）对比两次测序结果，挑选正确序列的转化菌，扩大培养后进行质粒抽提；（2.6）连接有目的单抗重链可变区(mVH)和轻链可变区(mVL)基因的表达载体共转染真核表达细胞株293；（2.7）收获的上清含有目的抗体，流式检测表达单抗与M435结合良好，阳性率达95%以上，表明已获得正确的抗体重链和轻链可变区序列。在本专利技术的一个优选实施例中，其中，步骤（2.6）中，所述真核表达细胞株293为悬浮培养，SFM4Transfx-293withoutL-glutamine(liquid)无血清培养基传代扩增，转染时用Gibco®FreeStyle™293ExpressionMedium无血清培养基替换；通过7天连续培养后收获上清，4000g离心30min，去除上清中细胞等杂质，并用0.45um滤器过滤除菌。作为本专利技术的第三方面一种抗人B7-H4单克隆抗体的应用，其特征在于，所述抗人B7-H4单克隆抗体用于制备用于肿瘤组织的免疫组化检测的试剂盒。作为本专利技术的第四方面的一种试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包含上述抗人B7-H4单克隆抗体。本专利技术的有益效果：本专利技术提供的抗人B7-H4单克隆抗体可以用于肿瘤组织的免疫组化检测，提高肿瘤标本免疫组化检测的精确度，有助于恶性肿瘤的诊断、确定原发部位和病理分型，提高肿瘤尤其是低分化或未分化肿瘤的诊断准确率。附图说明图1为Westernblot分析抗人B7-H4单抗4B2对B7-H4蛋白的识别示意图，图中结果显示，单抗4B2能特异性识别结合细胞裂解液中的B7-H4蛋白，目的条带清晰，阴性对照的Isotype和CHO/mock组没有结合条带。图中：IgGIsotype:同型抗体阴性对照；4B2:本专利技术抗人B7-H4单克隆抗体；CHO/mock细胞裂解液，CHO/B7-H4细胞裂解液。图2为采用细胞核染色体技术对获得的杂交瘤进行核型分析(×1000倍)示意图，图中杂交瘤细胞核型分析结果显示，杂交瘤细胞株的染色体数目在80条以上，超过小鼠B细胞和SP2/0细胞的染色体数，表明其为融合细胞。本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种抗人B7‑H4单克隆抗体，包括重链和轻链，其特征在于，所述重链可变区(mVH)的氨基酸序列与SEQ ID NO.1相同，具体如下：DVQLQESGPGLVKPSQSLSLTCTVTGYSITSDFAWNWIRQFPGNKLDWMGYISYSGDTNYNPSLKSRISITRDTSKNQFFLQLNSVTTEDTATYYCARDYGSGAWYFDVWGAGTTVTVSS；所述轻链可变区(mVL)的氨基酸序列与SEQ ID NO.2相同，具体如下：DIVMTQSPSSLAVSVGEKVTMSCKSSQSLLNSRTRKNYLAWYQQKPGQSPKLLIYWASTRESGVPDRFTGSGSGTDFILTISSVQAEDLAVYYCKQSYNLWTFGGGTKLEIK。

【技术特征摘要】
1.一种抗人B7-H4单克隆抗体，包括重链和轻链，其特征在于，所述重链可变区(mVH)的氨基酸序列与SEQIDNO.1相同，具体如下：DVQLQESGPGLVKPSQSLSLTCTVTGYSITSDFAWNWIRQFPGNKLDWMGYISYSGDTNYNPSLKSRISITRDTSKNQFFLQLNSVTTEDTATYYCARDYGSGAWYFDVWGAGTTVTVSS；所述轻链可变区(mVL)的氨基酸序列与SEQIDNO.2相同，具体如下：DIVMTQSPSSLAVSVGEKVTMSCKSSQSLLNSRTRKNYLAWYQQKPGQSPKLLIYWASTRESGVPDRFTGSGSGTDFILTISSVQAEDLAVYYCKQSYNLWTFGGGTKLEIK。2.如权利要求1所述的一种抗人B7-H4单克隆抗体，其特征在于，所述所述重链可变区(mVH)具有三个高变区为：GYSITSDFA、ISYSGDT、ARDYGSGAWYFDV。3.如权利要求1所述的一种抗人B7-H4单克隆抗体，其特征在于，所述轻链可变区(mVL)具有三个高变区为：QSLLNSRTRKNY、WAS、KQSYNLWT。4.权利要求1至3任一项权利要求所述的一种抗人B7-H4抗体重链和轻链可变区序列的鉴定方法，其特征在于，包括以下步骤：（1）B7-H4单克隆抗体的杂交瘤的制备；（1.1）免疫小鼠；（1.2）细胞培养；（1.3）融合与筛选；（2）B7-H4鼠/人嵌合抗体的制备；（2.1）提取杂交瘤细胞的cDNA：从该杂交瘤细胞株中提取RNA，并使用RT-PCR技术，将获得的RNA反转录为cDNA；利用特定设计的上下游引物PCR克隆该杂交瘤细胞的重链可变区(mVH)和轻链可变区(mVL)；所述特定设计的上下游引物的序列分别为核苷酸SEQIDNO.3和核苷酸序列4；（2.2）所述重链可变区(mVH)和轻链可变区(mVL)分别与克隆载...

【专利技术属性】
技术研发人员：张学光，
申请(专利权)人：苏州旭光科星生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏,32