本发明专利技术公开了一种抗人CD25嵌合单克隆抗体及其制备方法，包含编码所述抗体的可变区的氨基酸序列，制备方法，抗体功能鉴定。本发明专利技术从分泌抗人CD25单克隆抗体的杂交瘤细胞中提取重链可变区(mVH)和轻链可变区(mVL)，并与克隆载体(pJET cloning vector)连接，转化感受态细菌DH5a，根据测序结果保留候选的重轻链可变区序列，再次PCR扩增出与表达载体匹配的重链、轻链可变区序列，将PCR产物与双酶切预先处理的线性表达载体连接，连接产物转化感受态细菌DH5a，扩大培养后进行质粒抽提。连接有目的单抗重链和轻链可变区基因的表达载体共转染真核表达细胞株293。培养收获的上清含有目的抗体，流式检测表达单抗与PBMC结合良好，阳性率达95%以上，获得CD25鼠/人嵌合抗体。
【技术实现步骤摘要】
一种抗人CD25嵌合单克隆抗体及其制备方法和应用
本专利技术涉及一种抗体的制备方法，具体涉及一种抗人CD25嵌合单克隆抗体及其制备方法和应用，属于生物
技术介绍
CD25即白介素2（interleukin2，IL-2）异源三聚体受体复合物的α链，与IL-2受体β链（CD122）、γ链（CD132）形成IL-2受体复合物。IL-2即白细胞介素-2（interleukin-2，IL-2），又名T细胞生长因子(Tcellgrowthfactor，TCRF)。主要由活化的CD4+Th1细胞产生的具有广泛生物活性的细胞因子。可促进Th0和CTL的增殖，故为调控免疫应答的重要因子，也参与抗体反应、造血和肿瘤监视。IL-2受体α链胞浆区域较短，IL-2Rβ和IL-2Rγ的二聚体形式是IL-2信号通路的必须结构，但仅有IL-2Rβ和IL-2Rγ的二聚体形式存在时，IL-2无法有效的通过IL-2受体复合物信号通路调节T细胞增生，所以IL-2受体α即CD25有提高受体与IL-2的亲和力的功能，并主要表达于CD4+T细胞膜表面，参与调节性CD4+T细胞在IL-2的生理低水平下进行分化和增殖。白介素2受体复合物本身不具有激活信号通路能力，是通过与非受体型蛋白酪氨酸激酶偶联，激活下游信号传导通路，主要通过3条信号通路传导：①Jak-STAT途径，Jak激酶被激活，IL-2R胞内段Jak蛋白结合部分发生磷酸化，启动STAT因子转入细胞核中，使靶基因发挥调控细胞增殖与凋亡的作用；②MAP激酶途径，Jak激酶和Syk激酶活化后，使IL-2R胞内段发生磷酸化，引发Shc蛋白和Grb-2蛋白级联激活，使具有丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶活性的Raf-1蛋白启动MAP激酶途径，另外，在Jak激酶活化后还可以激动Pyk2激酶，从而启动MAP激酶途径，最终调节细胞周期蛋白依赖激酶对特定底物发挥作用，促进细胞增殖；③磷酸酰肌醇-3-激酶途径，需要Jak激酶、Pyk2激酶的参与，lck激酶作为启动因子，磷酸酰肌醇-3-激酶与Shc蛋白结合后刺激致癌基因Akt和p70、S6k表达，参与细胞凋亡及增殖活动。CD4+CD25+Foxp3+细胞是调节性T细胞（Treg）的检测表型，CD4+CD25+T细胞在部分研究中也被认定为Treg。CD4+CD25+T细胞在正常组织或外周血中，均有不同程度的比例，但是在肺癌、卵巢癌、胃肠道肿瘤、乳腺癌等多种恶性实体肿瘤患者的外周血和肿瘤局部组织细胞中均升高明显。调节性T细胞能分泌细胞增殖抑制因子，如IL-10，产生免疫抑制功能，也能通过细胞接触发挥抑制效应，两者可以同时存在，协同构成肿瘤环境中的免疫抑制反应。调节性T细胞主要分泌IL-10和TGF-β产生免疫抑制作用，其中IL-10有介导调节性T细胞与各种免疫细胞间的接触性免疫抑制功能。当肿瘤发生转移，形成淋巴结肿瘤浸润，淋巴节中上调的Treg协同肿瘤细胞阻碍抗肿瘤免疫效应。因此，肿瘤患者体内CD4+CD25+Foxp3+调节性T细胞水平升高是肿瘤疾病预后的不良因素。调节T细胞在慢性淋巴细胞白血病患者中表达升高，特别见于化疗前患者，在给予氟达拉滨治疗后水平下降，尽管氟达拉滨有减少CD4+T细胞副作用，但其主要疗效为减少前体T细胞，使慢淋患者调节T细胞的免疫抑制作用下降，下调免疫系统抑制信号传导通路活性，促使机体发挥抗肿瘤免疫作用，打破肿瘤免疫耐受。有研究提出，在给予白血病和纤维肉瘤患者抗CD25单克隆抗体药物后，可诱导肿瘤细胞凋亡。因此CD25也可以作为肿瘤治疗的靶点。
技术实现思路
本专利技术提供了一种抗人CD25嵌合单克隆抗体；本专利技术从分泌抗人CD25单克隆抗体的杂交瘤细胞中提取重链可变区(mVH)和轻链可变区(mVL)，根据测序结果保留候选的重轻链可变区序列，PCR扩增出与表达载体匹配的重链、轻链可变区序列，将PCR产物与双酶切预先处理的线性表达载体连接，连接产物转化感受态细菌DH5a。连接有目的单抗重链和轻链可变区基因的表达载体共转染真核表达细胞株293，培养收获的上清含有目的抗体，通过筛选和纯化获得CD25鼠/人嵌合抗体。本专利技术将抗人CD25单克隆可变区基因克隆到真核表达载体，转染293细胞，获得抗人CD25嵌合单克隆抗体再与其他类似抗体进行亲和力和生物学功能比较。为了实现上述目的，本专利技术的技术方案如下：作为本专利技术的第一方面，一种蛋白，其特征在于，所述蛋白是抗人CD25嵌合单克隆抗体的重链可变区(mVH)，其的氨基酸序列与SEQIDNO.1相同，QVQLKESGPGLVAPSQSLSITCTVSGFSLTSYAISWVRQPPGKGLEWLGVMWTGGGTNYNSALKSRLNISKDNSKSQVFLKMNSLQTEDTARYYCARPYYYDGSWFAYWGQGTLVTVSA。其中，所述重链可变区(mVH)具有三个高变区为：GFSLTSYA、MWTGGGT、ARPYYYDGSWFAY。作为本专利技术的第二方面，一种蛋白，其特征在于，所述蛋白是抗人CD25嵌合单克隆抗体的轻链可变区(mVL)，其的氨基酸序列与SEQIDNO.2相同，DIVLSQSPAILSASPGEKVTMTCRASSSVGYMHWYQQKPGSSPKPWIYATSNLASGVPVRFSGSESGTSYSLTISRVEAEDAATYYCQQWSSNPPTFGGGTKLEIK。其中，所述轻链可变区(mVL)具有三个高变区为：SSVGY、ATS、QQWSSNPPT。作为本专利技术的第三方面，一种抗人CD25嵌合单克隆抗体的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：一、CD25单克隆抗体的杂交瘤的制备；（一）免疫小鼠；（二）细胞培养；（三）融合与筛选；二、CD25鼠/人嵌合抗体的制备；（1）提取杂交瘤细胞的cDNA：从该杂交瘤细胞株中提取RNA，并使用RT-PCR技术，将获得的RNA反转录为cDNA；利用特定设计的上下游引物PCR克隆该杂交瘤细胞的重链可变区(mVH)和轻链可变区(mVL)；（1）所述重链可变区(mVH)和轻链可变区(mVL)分别与克隆载体(pJETcloningvector)连接，连接产物转化感受态细菌DH5a，由于pJET载体带有氨苄(Amp+)抗性基因，可将转化菌液涂在Amp抗性的LB固体培养基上，37°过夜培养；（2）待涂板细菌长出分散菌落，选择边缘清晰、生长良好的菌落，进一步测序鉴定；（3）根据测序结果保留候选的重链可变区(mVH)和轻链可变区(mVL)序列，再次PCR扩增出与表达载体匹配的重链可变区(mVH)和轻链可变区(mVL)序列，将PCR产物与双酶切预先处理的线性表达载体连接，连接产物转化感受态细菌DH5a，由于表达载体带有卡那霉素(Kana+)抗性基因，可将转化菌液涂在Kana抗性的LB固体培养基上，37°过夜培养；（4）测序方法参照（4）对比两次测序结果，挑选正确序列的转化菌，扩大培养后进行质粒抽提；（5）连接有目的单抗重链可变区(mVH)和轻链可变区(mVL)基因的表达载体共转染真核表达细胞株293；其中，步骤（5）中，所述真核表达细胞株293为悬浮培养，SFM4Transfx-293withoutL-glutamine(liquid)无血清培养基传代扩增，转染时用本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种蛋白，其特征在于，所述蛋白是抗人CD25嵌合单克隆抗体的重链可变区(mVH)，其的氨基酸序列与SEQ ID NO.1相同，QVQLKESGPGLVAPSQSLSITCTVSGFSLTSYAISWVRQPPGKGLEWLGVMWTGGGTNYNSALKSRLNISKDNSKSQVFLKMNSLQTEDTARYYCARPYYYDGSWFAYWGQGTLVTVSA。
【技术特征摘要】
1.一种蛋白，其特征在于，所述蛋白是抗人CD25嵌合单克隆抗体的重链可变区(mVH)，其的氨基酸序列与SEQIDNO.1相同，QVQLKESGPGLVAPSQSLSITCTVSGFSLTSYAISWVRQPPGKGLEWLGVMWTGGGTNYNSALKSRLNISKDNSKSQVFLKMNSLQTEDTARYYCARPYYYDGSWFAYWGQGTLVTVSA。2.根据权利要求1所述的一种蛋白，其特征在于，所述重链可变区(mVH)具有三个高变区为：GFSLTSYA、MWTGGGT、ARPYYYDGSWFAY。3.一种蛋白，其特征在于，所述蛋白是抗人CD25嵌合单克隆抗体的轻链可变区(mVL)，其的氨基酸序列与SEQIDNO.2相同，DIVLSQSPAILSASPGEKVTMTCRASSSVGYMHWYQQKPGSSPKPWIYATSNLASGVPVRFSGSESGTSYSLTISRVEAEDAATYYCQQWSSNPPTFGGGTKLEIK。4.根据权利要求3所述的一种蛋白，其特征在于，所述轻链可变区(mVL)具有三个高变区为：SSVGY、ATS、QQWSSNPPT。5.一种抗人CD25嵌合单克隆抗体的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：CD25单克隆抗体的杂交瘤的制备；免疫小鼠；细胞培养；（三）融合与筛选；CD25鼠/人嵌合抗体的制备；（1）提取杂交瘤细胞的cDNA：从该杂交瘤细胞株中提取RNA，并使用RT-PCR技术，将获得的RNA反转录为cDNA；利用特定设计的上下游引物PCR克隆该杂交瘤细胞的重链可变区(mVH)和轻链可变区(mVL)；（2）所述重链可变区(mVH)和轻链可变区(mVL)分别与克隆载体(pJETcloningvector)连接，连接产物转化感受态细菌DH5a，由于pJET载体带有氨苄(Amp+)抗性基因，可将转化菌液涂在Amp抗性的LB固体培养基上，37°过夜培养；（3）待涂板细菌长出分散菌落，选择边缘清晰、生长良好的菌落，进一步测序鉴定；（4）根据测序结果保留候选的重链可变区(mVH)和轻链可变区(mVL)序列，再次PCR扩增出与表达载体匹配的重链可变区(mVH)和轻链可变区(mVL)序列，将PCR产物与双酶切预先处理的线性表达载体连接，连接产物转化感受态细菌DH5a，由于表达载体带有卡那霉素(Kana+)抗性基因，可将转化菌液涂在Kana抗性...
【专利技术属性】
技术研发人员：张学光，
申请(专利权)人：苏州旭光科星生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏,32
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