一种抗中华蜜蜂囊状幼虫病病毒的卵黄抗体复合制剂及制备制造技术

本发明专利技术属于动物生物制品技术领域，具体涉及一种抗中华蜜蜂囊状幼虫病病毒的卵黄抗体复合制剂及制备。本发明专利技术将氧化石墨烯悬浊液和壳聚糖溶液混合搅拌，得到氧化石墨烯/壳聚糖佐剂；在氧化石墨烯/壳聚糖佐剂中加入中华蜜蜂囊状幼虫病病毒粒子溶液，得到氧化石墨烯/壳聚糖病毒疫苗；以该疫苗作为免疫抗原免疫蛋鸡，收集免疫蛋鸡产下的鸡蛋，分离蛋清与蛋黄，提取卵黄抗体，纯化，得到抗中华蜜蜂囊状幼虫病病毒的卵黄抗体；将藻类提取液与卵黄抗体混合，得到抗中华蜜蜂囊状幼虫病病毒的卵黄抗体复合制剂。该卵黄抗体复合制剂生物效价高、预防和治疗效果好、无任何毒副残留、特异性强、作用迅速、且持续作用长等优点。

Compound preparation and preparation of yolk antibody against Chinese honeybee cystic larvae virus

The invention belongs to the technical field of animal biological products, in particular to a compound preparation of yolk antibody against Chinese bee cystic larva virus and its preparation. The invention mixes graphene oxide suspension and chitosan solution to obtain graphene oxide/chitosan adjuvant; adds Chinese bee cystic larvae virus particle solution to graphene oxide/chitosan adjuvant to obtain graphene oxide/chitosan virus vaccine; immunizes laying hens with the vaccine as an immune antigen, collects the eggs laid by immunized laying hens, and separates the egg white and yolk. To extract yolk antibody, purify and obtain yolk antibody against Apis cerana cystic larvae virus, and mix algae extract with yolk antibody to obtain yolk antibody complex preparation against Apis cerana cystic larvae virus. The yolk antibody complex has the advantages of high bioavailability, good prevention and treatment effect, no toxic and side-effects, strong specificity, rapid action and long lasting effect.

【技术实现步骤摘要】
一种抗中华蜜蜂囊状幼虫病病毒的卵黄抗体复合制剂及制备
本专利技术属于动物生物制品
，具体涉及一种抗中华蜜蜂囊状幼虫病病毒的卵黄抗体复合制剂及制备。
技术介绍
中华蜜蜂作为一种宝贵的资源对蜂蜜生产和全球粮食生产做出了巨大的贡献，在一定程度上促进了全球经济的发展。蜜蜂在维系动植物生态平衡等方面也起着极为重要的作用。由于中华蜜蜂囊状幼虫病病毒(ChineseSacbroodBeeVirus，CSBV)主要感染1～3日龄幼虫，致使幼虫的感染率和死亡率极高，最终造成蜂群的大面积死亡，给蜜蜂产业带来了巨大的经济损失。CSBV是传染性软腐病病毒科属，其直径为26～30nm，是一种二十面体、无包膜、正链RNA病毒颗粒。感染CSBV幼虫的颜色从乳白色变为淡黄色，死亡后不久逐渐变得干枯，变为了暗褐色。CSBV最早于1972年发现于广东，2008年在辽宁重新出现，大面积感染蜂群后，造成了农业和自然生态系统的毁灭性的打击。目前，已经利用多种方法尝试性的进行了该疾病的控制。如喂食异源性蜂王浆、dsRNA和重组表达的病毒结构蛋白等。上述多种方法由于存在这样或那样的不足，使得上述方法在实际应用中得到了限制。为了克服上述方法存在的不足之处，利用卵黄抗体进行病毒性疾病的预防和治疗是较为常用的方法之一，且效果好，制备简单。为此，本专利技术基于此背景条件下，成功制备了抗中华蜜蜂囊状幼虫病病毒的卵黄抗体复合制剂，供预防和治疗中华蜜蜂抗CSBV感染应用。
技术实现思路
为了克服现有技术的不足和缺点，本专利技术的首要目的在于提供一种抗中华蜜蜂囊状幼虫病病毒的卵黄抗体复合制剂的制备方法。本专利技术的另一目的在于提供上述制备方法制备得到的抗中华蜜蜂囊状幼虫病病毒的卵黄抗体复合制剂。本专利技术的再一目的在于提供上述抗中华蜜蜂囊状幼虫病病毒的卵黄抗体复合制剂的应用。本专利技术的目的通过下述技术方案实现：一种抗中华蜜蜂囊状幼虫病病毒的卵黄抗体复合制剂的制备方法，包含如下步骤：(1)将壳聚糖(CS)溶解在质量分数为0.5～2％的乙酸溶液中，得到质量分数为2.5～10％的壳聚糖溶液；(2)在20～40℃下，将0.25～1.25mg/ml的氧化石墨烯(GO)悬浊液首次超声处理，使体系分散均匀；然后将其与等体积的步骤(1)制得的壳聚糖溶液混合后再次超声处理，使体系分散均匀；随后20～40℃搅拌0.5～3.5h，得到氧化石墨烯/壳聚糖(GO/CS)佐剂；(3)在步骤(2)制得的氧化石墨烯/壳聚糖佐剂中逐滴缓慢加入中华蜜蜂囊状幼虫病病毒(CSBV)粒子溶液，充分混合均匀，然后20～40℃搅拌0.5～2.5h，得到氧化石墨烯/壳聚糖病毒疫苗；(4)将步骤(3)制得的氧化石墨烯/壳聚糖病毒疫苗作为免疫抗原免疫蛋鸡，收集免疫蛋鸡产下的鸡蛋，分离蛋清与蛋黄，提取卵黄抗体，纯化，得到抗中华蜜蜂囊状幼虫病病毒的卵黄抗体；(5)将藻类提取液与步骤(4)制得的卵黄抗体混合，得到抗中华蜜蜂囊状幼虫病病毒的卵黄抗体复合制剂，其中，藻类提取液的用量为卵黄抗体质量的0.1～10％；步骤(2)中所述的首次超声处理的条件优选为200W，40kHz超声处理5～15min，使体系分散均匀，分散度好；步骤(2)中所述的再次超声处理的条件优选为200W，40kHz超声处理5～20min，使体系分散均匀，分散度好；步骤(3)中所述的氧化石墨烯/壳聚糖病毒疫苗中病毒粒子的浓度优选为0.20～5mg/ml；步骤(3)中所述的中华蜜蜂囊状幼虫病病毒粒子优选为如下毒株病毒粒子的至少两种：江西株、北京株、陕西株(例如：CSBV-SXYL株)、辽宁株(例如：CSBV-LN/2009)、福建株、河南株、云南株、四川株等；步骤(3)中所述的中华蜜蜂囊状幼虫病病毒粒子溶液的制备方法，包含如下步骤：①中华蜜蜂囊状幼虫病病毒的人工繁殖：将不同中华蜜蜂囊状幼虫病病毒毒株分别感染蜜蜂幼虫，然后将感染后的幼虫等质量混合；取5～15g感染中华蜜蜂囊状幼虫病病毒的蜜蜂幼虫匀浆均质化，离心，收集含有病毒的上清液；将含有病毒的上清液去感染80～480只健康蜜蜂幼虫，收集感染中华蜜蜂囊状幼虫病病毒的蜜蜂幼虫；②中华蜜蜂囊状幼虫病病毒的纯化：将步骤①收集到的感染中华蜜蜂囊状幼虫病病毒的蜜蜂幼虫匀浆均质化，离心，收集含有病毒的上清液；用0.2MPBS缓冲液将沉淀重悬，再次匀浆后离心，收集含有病毒的上清液，合并两次收集到的含有病毒的上清液；将含有病毒的上清液与等体积的氯仿混合，再次匀浆均质化，然后进行差速离心，弃沉淀取上清液；将上清液进行超速离心，弃上清液取沉淀，得到病毒粒子；病毒粒子用PBS缓冲液稀释，得到中华蜜蜂囊状幼虫病病毒(CSBV)粒子溶液；所述的匀浆优选采用玻璃匀浆器进行匀浆，至完全均质化；所述的匀浆的条件优选为在冰浴上匀浆5～30min；所述的差速离心的条件优选为：1000rpm离心10min，5000rpm离心30min，15000rpm离心30min；所述的超速离心的条件优选为35000rpm离心60min；步骤(4)中所述的蛋鸡优选采用2个月开产日龄的蛋鸡；步骤(4)中所述的氧化石墨烯/壳聚糖病毒疫苗作为抗原免疫蛋鸡的具体步骤优选为：将氧化石墨烯/壳聚糖病毒疫苗作为抗原，采用皮下多点注射结合肌肉注射方式对蛋鸡进行注射；初次免疫后，每隔10天加强免疫一次，进行多次免疫；所述的皮下多点注射的部位优选为颈部、双翅根部、背部和胸大肌部位等处；所述的肌肉注射的部位优选为鸡一侧大腿外侧肌肉最为丰富处；所述的注射的用量优选为1ml/鸡，0.2ml/位点，初次免疫剂量和后续加强免疫剂量相同；所述的多次免疫优选为免疫至抗体效价达到25以上；步骤(4)中所述的提取鸡蛋中的卵黄抗体、纯化的具体操作优选为：将蛋黄从蛋清中分离出来，将PBS缓冲液与蛋黄按(2～10):1的体积比混合，搅拌均匀后加入PEG6000试剂，使其最终浓度为2.0～5.5wt％；将该混合物在20～40℃下搅拌20～60min，2000～8000rpm离心10～60min，收集上清液，得到卵黄抗体；步骤(5)中所述的藻类优选为盐藻、小球藻、螺旋藻和雨声红球藻中的至少一种；步骤(5)中所述的藻类提取液的制备方法优选为：在藻类中加入淡水调整细胞湿重为200g/L，然后在80～120MPa的高压条件下破碎藻类细胞，低速离心，收集上清，得到藻类提取液；一种抗中华蜜蜂囊状幼虫病病毒的卵黄抗体复合制剂，通过上述制备方法制备得到；所述的抗中华蜜蜂囊状幼虫病病毒的卵黄抗体复合制剂在制备预防和治疗中华蜜蜂囊状幼虫病病毒感染产品中的应用；本专利技术相对于现有技术具有如下的优点及效果：(1)本专利技术进行了三种免疫佐剂的效果比较，同时进行了不同免疫间隔时间和次数的比较，结果显示在三种免疫佐剂中，利用氧化石墨烯/壳聚糖(GO/CS)佐剂在免疫间隔10天时，抗体效价最高，成功建立起来了一种高效制备抗CSBV感染卵黄抗体的蛋鸡免疫程序。(2)本专利技术采用不同地区来源的中华蜜蜂囊状幼虫病病毒毒株制备氧化石墨烯/壳聚糖病毒疫苗并作为免疫抗原免疫蛋鸡，制得的卵黄抗体克服了地域性差异带来的抗体效果差、持续时间短等问题。(3)本专利技术在制得的卵黄抗体中添加了藻类提取液，不仅提高了蜜蜂幼虫的生长发育速度和抗病能力，而且提高了蜜蜂对卵黄抗体应本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种抗中华蜜蜂囊状幼虫病病毒的卵黄抗体复合制剂的制备方法，其特征在于包含如下步骤：(1)将壳聚糖溶解在质量分数为0.5～2％的乙酸溶液中，得到质量分数为2.5～10％的壳聚糖溶液；(2)在20～40℃下，将0.25～1.25mg/ml的氧化石墨烯悬浊液首次超声处理，使体系分散均匀；然后将其与等体积的步骤(1)制得的壳聚糖溶液混合后再次超声处理，使体系分散均匀；随后20～40℃搅拌0.5～3.5h，得到氧化石墨烯/壳聚糖佐剂；(3)在步骤(2)制得的氧化石墨烯/壳聚糖佐剂中逐滴缓慢加入中华蜜蜂囊状幼虫病病毒粒子溶液，充分混合均匀，然后20～40℃搅拌0.5～2.5h，得到氧化石墨烯/壳聚糖病毒疫苗；(4)将步骤(3)制得的氧化石墨烯/壳聚糖病毒疫苗作为免疫抗原免疫蛋鸡，收集免疫蛋鸡产下的鸡蛋，分离蛋清与蛋黄，提取卵黄抗体，纯化，得到抗中华蜜蜂囊状幼虫病病毒的卵黄抗体；(5)将藻类提取液与步骤(4)制得的卵黄抗体混合，得到抗中华蜜蜂囊状幼虫病病毒的卵黄抗体复合制剂，其中，藻类提取液的用量为卵黄抗体质量的0.1～10％。

【技术特征摘要】
1.一种抗中华蜜蜂囊状幼虫病病毒的卵黄抗体复合制剂的制备方法，其特征在于包含如下步骤：(1)将壳聚糖溶解在质量分数为0.5～2％的乙酸溶液中，得到质量分数为2.5～10％的壳聚糖溶液；(2)在20～40℃下，将0.25～1.25mg/ml的氧化石墨烯悬浊液首次超声处理，使体系分散均匀；然后将其与等体积的步骤(1)制得的壳聚糖溶液混合后再次超声处理，使体系分散均匀；随后20～40℃搅拌0.5～3.5h，得到氧化石墨烯/壳聚糖佐剂；(3)在步骤(2)制得的氧化石墨烯/壳聚糖佐剂中逐滴缓慢加入中华蜜蜂囊状幼虫病病毒粒子溶液，充分混合均匀，然后20～40℃搅拌0.5～2.5h，得到氧化石墨烯/壳聚糖病毒疫苗；(4)将步骤(3)制得的氧化石墨烯/壳聚糖病毒疫苗作为免疫抗原免疫蛋鸡，收集免疫蛋鸡产下的鸡蛋，分离蛋清与蛋黄，提取卵黄抗体，纯化，得到抗中华蜜蜂囊状幼虫病病毒的卵黄抗体；(5)将藻类提取液与步骤(4)制得的卵黄抗体混合，得到抗中华蜜蜂囊状幼虫病病毒的卵黄抗体复合制剂，其中，藻类提取液的用量为卵黄抗体质量的0.1～10％。2.根据权利要求1所述的抗中华蜜蜂囊状幼虫病病毒的卵黄抗体复合制剂的制备方法，其特征在于：步骤(2)中所述的首次超声处理的条件为200W，40kHz超声处理5～15min；步骤(2)中所述的再次超声处理的条为200W，40kHz超声处理5～20min。3.根据权利要求1所述的抗中华蜜蜂囊状幼虫病病毒的卵黄抗体复合制剂的制备方法，其特征在于：步骤(3)中所述的氧化石墨烯/壳聚糖病毒疫苗中病毒粒子的浓度为0.20～5mg/ml。4.根据权利要求1所述的抗中华蜜蜂囊状幼虫病病毒的卵黄抗体复合制剂的制备方法，其特征在于：步骤(3)中所述的中华蜜蜂囊状幼虫病病毒粒子为如下毒株病毒粒子的至少两种：江西株、北京株、陕西株、辽宁株、福建株、河南株、云南株、四川株。5.根据权利要求4所述的抗中华蜜蜂囊状幼虫病病毒的卵黄抗体复合制剂的制备方法，其特征在于：...

【专利技术属性】
技术研发人员：冯书营，杜景霞，李爱芳，李艳，胡丽娜，叶晓君，于梦园，焦燕，李静雅，张海州，杨金芳，
申请(专利权)人：河南科技大学，
类型：发明
国别省市：河南,41