一种口蹄疫诊断试剂盒及其所用口蹄疫诊断抗原制造技术

本发明专利技术公开了一种口蹄疫诊断试剂盒及其所用口蹄疫诊断抗原。该抗原为R1)、R2)或R3)的蛋白质：R1)氨基酸序列是SEQ ID No.2的蛋白质，R2)氨基酸序列是SEQ ID No.2的第166‑282位的蛋白质，R3)在R1)或R2)所示的蛋白质的羧基端或/和氨基端融合标签蛋白得到的具有与R1)或R2)相同活性的可溶性融合蛋白。以上述诊断抗原制备的抗体检测试剂盒敏感性高，准确性高，操作简单、快速，能够作为鉴别口蹄疫野毒感染与疫苗免疫抗体检测试剂盒，该方法适用于基层各级兽医部门和出入境检验检疫局对口蹄疫野毒感染血清抗体的快速大量筛选检测，为口蹄疫的防控和净化提供重要技术手段。

A diagnostic kit for foot-and-mouth disease and its diagnostic antigen

The invention discloses a diagnostic kit for foot-and-mouth disease and a diagnostic antigen for foot-and-mouth disease. The antigen is a protein of R1, R2, or R3: R1) amino acid sequence is a protein of SEQ ID No. 2, R2) amino acid sequence is a protein of 166 282 of SEQ ID No. 2, and R3) is a protein of carboxyl or/and amino terminal fusion label of R1 or R2, resulting in a soluble fusion protein with the same activity as R1 or R2. The test kit prepared with the above diagnostic antigens has high sensitivity, accuracy, simplicity and rapidity. It can be used as a kit for identifying wild foot-and-mouth disease virus infection and vaccine immune antibody detection. This method is suitable for rapid screening and detection of serum antibodies against wild foot-and-mouth disease virus infection by veterinary departments at all levels and entry-exit inspection and quarantine bureaus at the grass-roots level. It can be used for the prevention and purification of foot-and mouth disease. Provide important technical means.

【技术实现步骤摘要】
一种口蹄疫诊断试剂盒及其所用口蹄疫诊断抗原
本专利技术涉及一种口蹄疫诊断试剂盒及其所用口蹄疫诊断抗原。
技术介绍
口蹄疫(FootandMouthDisease，FMD)是由口蹄疫病毒(FootandMouthDiseaseVirus，FMDV)引起的偶蹄动物急性、热性、高度接触传染性传染病。在口蹄疫防治工作中的主要措施是用口蹄疫灭活疫苗对易感动物进行免疫。但是这种措施同时也对口蹄疫免疫动物与感染动物鉴别诊断带来了困难。因此，开展口蹄疫的鉴别诊断技术研究在预防、控制、扑灭和净化该病具有非常重要的意义。病毒分离技术是OIE规定的诊断FMD的金标准，该方法虽然较为准确，但需要耗费约几天的时间才能获得结果，并且操作技术复杂，生物安全要求高，不适用于基层兽医快速诊断需求。反转录PCR和实时定量PCR已经广泛用于检测FMDV。但这两种方法需要专业人员在专业的实验室内开展，也给基层检测人员诊断FMD带来了一定的困难。目前对于FMDV野毒感染的血清学诊断方法来说，使用最为普遍的是基于FMDV非结构蛋白(NonStructureProtein)3ABC的ELISA技术。但是，3ABC蛋白由于自身氨基酸结构特征以及序列较长等因素，真核系统表达较为困难，原核表达后基本为蛋白的包涵体结构。因为包涵体中的表达产物不具有生物学活性，因而需要进行变性与复性处理。蛋白的变性与复性是一个极其复杂的过程，不同蛋白的复性条件各异，复性率往往很难提高。这是限制抗原活性的主要制约因素。
技术实现思路
本专利技术所要解决的一个技术问题是如何提高口蹄疫病毒的血清学抗体检测的灵敏度，并且降低漏检率和假阳性率，从而更灵敏、更准确地诊断口蹄疫。为了解决上述技术问题，本专利技术提供了蛋白质在制备抗原中的应用。本专利技术所提供的蛋白质在制备抗原中的应用中，所述抗原可为口蹄疫诊断抗原或检测口蹄疫病毒感染抗体的抗原，所述蛋白质可为R1)、R2)或R3)的蛋白质：R1)氨基酸序列是SEQIDNo.2的蛋白质，R2)氨基酸序列是SEQIDNo.2的第166-282位的蛋白质，R3)在R1)或R2)所示的蛋白质的羧基端或/和氨基端融合标签蛋白得到的具有与R1)或R2)相同活性的可溶性融合蛋白。上述应用中，所述抗原可为所述蛋白质。上述应用中，所述标签蛋白(protein-tag)是指利用DNA体外重组技术，与目的蛋白一起融合表达的一种多肽或者蛋白，以便于目的蛋白的表达、检测、示踪和/或纯化。所述标签蛋白可为Flag标签蛋白、His标签蛋白、MBP标签蛋白、HA标签蛋白、myc标签蛋白、GST标签蛋白和/或SUMO标签蛋白等。上述应用中，R1)的蛋白质名称为rtagP3AB1B2，R2)的蛋白质名称为rP3AB1B2。SEQIDNo.2由290个氨基酸残基组成。上述应用中，所述蛋白质可按照包括如下步骤的方法制备：使所述蛋白质的编码基因在生物中进行表达得到所述蛋白质，所述生物可为微生物、植物或非人动物。上述应用中，使所述蛋白质的编码基因在生物中进行表达可包括将所述蛋白质的编码基因导入受体微生物，得到表达所述蛋白质的重组微生物，培养所述重组微生物，表达得到所述蛋白质。上述应用中，所述受体微生物可为C1)-C4)中的任一种:C1)原核微生物，C2)革兰氏阴性细菌，C3)埃希氏菌属细菌，C4)大肠杆菌BL21(DE3)。上述应用中，所述蛋白质的编码基因可为如下1)-4)中任一所述的DNA分子：1)编码序列是SEQIDNo.1的的DNA分子，2)核苷酸序列是SEQIDNo.1的DNA分子，3)编码序列是SEQIDNo.1的第496-846位核苷酸的DNA分子，4)核苷酸序列是SEQIDNo.1的第496-846位核苷酸的DNA分子。上述应用中，所述重组微生物可为将pET32a-3AB1B2导入大肠杆菌BL21(DE3)得到的表达氨基酸序列是SEQIDNo.2的蛋白质的重组微生物，所述重组微生物命名为BL21(DE3)/pET32a-3AB1B2，所述pET32a-3AB1B2是用核苷酸序列是SEQIDNo.1的第490-852位的DNA替换pET32a(+)的BamHI和XhoI识别位点间的片段，保持pET32a(+)的其它序列不变，得到的重组表达载体。上述应用中，所述表达可为诱导表达。上述应用中，所述诱导表达是用0.75mM的IPTG在16℃诱导13-16小时或13小时。为了解决上述技术问题，本专利技术还提供了一种试剂盒。本专利技术所提供的试剂盒为诊断口蹄疫的时间分辨荧光免疫分析(TRFIA)试剂盒或检测口蹄疫病毒抗体的时间分辨荧光免疫分析试剂盒，所述试剂盒包括包被抗原，所述包被抗原为上述蛋白质。所述试剂盒还包括进行时间分辨荧光免疫分析所需的其它试剂，如稀土元素标记的二抗。所述稀土元素可为铕(Eu3+)、镝(De3+)、铽(Te3+)、钐(Sm3+)。上述试剂盒在制备口蹄疫监测试剂盒中的应用也属于本专利技术的保护范围。本专利技术将FMDV的非结构蛋白3A片段、3B1和3B2通过连接肽连接在一起得到融合蛋白rP3AB1B2，将rP3AB1B2基因插入到pET32a(+)的BamHI和XhoI识别位点间得到可以表达融合蛋白rtagP3AB1B2的重组表达载体pET32a-3AB1B2，将pET32a-3AB1B2导入大肠杆菌BL21(DE3)获得可溶性表达的rtagP3AB1B2。用可溶性表达的rtagP3AB1B2作为目的诊断抗原和/或检测抗原检测血清中的非结构蛋白抗体可以用来区分疫苗免疫动物与野毒感染动物；其次非结构蛋白不分血清型，用可溶性表达的rtagP3AB1B2作为目的诊断抗原和/或检测抗原建立的检测血清中的非结构蛋白抗体的ELISA和时间分辨免疫荧光分析法可以对口蹄疫的七种血清型进行检测。本专利技术的rtagP3AB1B2不仅可溶性表达比例高，而且与3ABC全抗原相比，检测的敏感性相当，特异性更好，准确性更高：1、本专利技术利用大肠杆菌表达的rtagP3AB1B2占菌体总蛋白的62％，95％为可溶。本专利技术利用大肠杆菌获得的可溶表达的rtag3AB1B2，为进一步开发鉴别口蹄疫野毒感染与疫苗免疫抗体检测试剂盒奠定了非常好的基础。2、将可溶表达的rtag3AB1B2作为包被抗原建立的时间分辨荧光免疫分析检测口蹄疫病毒抗体方法的敏感性与rtag3ABC作为包被抗原建立的时间分辨荧光免疫分析检测口蹄疫病毒抗体方法的敏感性相当，但是明显高于采用rtag3B1B2、rtagP3A和rtag3A作为包被抗原建立的时间分辨荧光免疫分析检测口蹄疫病毒抗体方法的敏感性，也明显高于瑞士PRIONICS口蹄疫NS抗体检测试剂盒的敏感性。3、将可溶表达的rtag3AB1B2作为包被抗原建立的时间分辨荧光免疫分析检测口蹄疫病毒抗体的方法与瑞士PRIONICS口蹄疫NS抗体检测试剂盒的总符合率显著高于分别以rtag3ABC、rtag3B1B2、rtagP3A和rtag3A作为包被抗原建立的时间分辨荧光免疫分析检测口蹄疫病毒抗体的方法。本专利技术以可溶表达的rtagP3AB1B2为诊断抗原和/或检测抗原制备的抗体检测试剂盒敏感性高，准确性高，操作简单、快速，适用于基层各级兽医部门和出入境检验检疫局对口蹄疫野毒感染血清抗体的快速大量筛本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.蛋白质在制备抗原中的应用，其特征在于：所述抗原为口蹄疫诊断抗原或检测口蹄疫病毒感染抗体的抗原，所述蛋白质为R1)、R2)或R3)的蛋白质：R1)氨基酸序列是SEQ ID No.2的蛋白质，R2)氨基酸序列是SEQ ID No.2的第166‑282位的蛋白质，R3)在R1)或R2)所示的蛋白质的羧基端或/和氨基端融合标签蛋白得到的具有与R1)或R2)相同活性的可溶性融合蛋白。

【技术特征摘要】
1.蛋白质在制备抗原中的应用，其特征在于：所述抗原为口蹄疫诊断抗原或检测口蹄疫病毒感染抗体的抗原，所述蛋白质为R1)、R2)或R3)的蛋白质：R1)氨基酸序列是SEQIDNo.2的蛋白质，R2)氨基酸序列是SEQIDNo.2的第166-282位的蛋白质，R3)在R1)或R2)所示的蛋白质的羧基端或/和氨基端融合标签蛋白得到的具有与R1)或R2)相同活性的可溶性融合蛋白。2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述蛋白质按照包括如下步骤的方法制备：使所述蛋白质的编码基因在生物中进行表达得到所述蛋白质，所述生物为微生物、植物或非人动物。3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：使所述蛋白质的编码基因在生物中进行表达包括将所述蛋白质的编码基因导入受体微生物，得到表达所述蛋白质的重组微生物，培养所述重组微生物，表达得到所述蛋白质。4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于：所述受体微生物为C1)-C4)中的任一种:C1)原核微生物，C2)革兰氏阴性细菌，C3)埃希氏菌属细菌，C4)大肠杆菌BL21(DE3)。5.根据权利要求2-4中任一所述的应用，其特征在于：所述蛋白质的编码基因为如下1)-4)中任一所述的DNA分子：1)编码序列是SEQIDNo.1的的DNA分子，2)核苷酸序列是...

【专利技术属性】
技术研发人员：孙雨，宋晓晖，王传彬，肖颖，赵晓春，毕一鸣，杨林，王睿男，李硕，董浩，蒋菲，马英，韩焘，李晓霞，亢文华，曲萍，刘玉良，张存瑞，杨天意，张晨，孙航，冯冰，王旭，
申请(专利权)人：中国动物疫病预防控制中心农业部屠宰技术中心，
类型：发明
国别省市：北京,11