促进tau蛋白去磷酸化的嵌合体及其编码基因以及它们的应用制造技术

本发明专利技术涉及基因工程技术领域，具体涉及促进tau蛋白去磷酸化的嵌合体及其编码基因以及它们的应用。该嵌合体包括tau蛋白结合序列、连接序列、磷酸酯酶募集序列和穿膜肽序列，所述tau蛋白结合序列与所述磷酸酯酶募集序列通过连接序列连接。本发明专利技术通过将编码本发明专利技术提供的促进tau蛋白去磷酸化的嵌合体的基因克隆到质粒中，获得的重组质粒，使用该质粒处理SD大鼠原代神经元或转染htau‑GFP的HEK293细胞，可有效降低tau蛋白在Ser396和AT8表位的磷酸化水平。由此表明，本发明专利技术所述的促进tau蛋白去磷酸化的嵌合体可在预防和治疗包括阿尔茨海默病在内的一系列tau疾病中发挥作用。

Chimeras promoting dephosphorylation of tau protein and their coding genes and their applications

The invention relates to the field of genetic engineering technology, in particular to chimeras that promote dephosphorylation of tau protein, their coding genes and their applications. The chimera includes tau protein binding sequence, ligation sequence, phosphatase recruitment sequence and transmembrane peptide sequence. The tau protein binding sequence and the phosphatase recruitment sequence are connected through the ligation sequence. The present invention can effectively reduce the phosphorylation level of tau protein at Ser396 and AT8 epitopes by cloning the gene encoding tau protein dephosphorylation chimerism provided by the present invention into the plasmid, obtaining the recombinant plasmid and treating primary neurons of SD rats or HEK293 cells transfected with htau GFP with the plasmid. The results show that the chimera promoting dephosphorylation of tau protein described in the present invention can play a role in preventing and treating a series of tau diseases including Alzheimer's disease.

【技术实现步骤摘要】
促进tau蛋白去磷酸化的嵌合体及其编码基因以及它们的应用
本专利技术涉及基因工程
，具体涉及促进tau蛋白去磷酸化的嵌合体及其编码基因以及它们的应用。
技术介绍
阿尔茨海默病(Alzheimer’sdisease,AD)是最常见的一种痴呆症，约占痴呆症的50-70％。据统计，2016年中国有约1000万，全球则有4400万AD患者。随着人口的老龄化，AD的发病率将进一步上升，预计到2050年中国将有约4000万AD患者。目前所有治疗AD的药物都是表征药物(Symptomaticdrugs)，只能短暂缓解症状而不能延缓病情的进展。全球迫切期待有能真正改变AD进展的新药(Disease-modifyingdrugs)。AD的两个特征性的病理变化是老年斑(Senileplaques，SPs)及神经原纤维缠结(Neurofibrillarytangles,NFTs)，分别是由β-淀粉样蛋白(Aβ)及高度磷酸化的tau蛋白形成的聚合物，其中tau病变而不是Aβ病变与AD的痴呆程度呈正相关。最新的研究显示高度磷酸化的tau介导Aβ诱导的神经毒性，为Aβ的神经毒性所必需；并且高度磷酸化的tau是朊脘病毒样蛋白(Prion-likeprotein)，能在神经元间传播从而导致tau病变的扩散，提示其可能是AD必需的药物靶点。除了AD外，高度磷酸化的tau的聚集也见于连锁于17号染色体伴帕金森病的额颞叶痴呆(frontotemporaldementialinkedtochromosome-17parkinsonism,FTDP-17)、皮克氏病(Pick’sdisease,PiD)、进行性核上麻痹(progressivesupranuclearpalsy,PSP)、皮质基底节变性(corticobasaldegeneration,CBD)、原发性年龄相关性tau病(primaryage-relatedtauopathy,PART)、嗜银颗粒病(argyrophilicgraindisease,AGD)、老化相关tau星形胶质细胞病(aging-relatedtauastrogliopathy,ARTAG)、慢性创伤性脑病(chronictraumaticencephalopathy,CTE)、球形胶质细胞tau病变(Globularglialtauopathy,GGT)、帕金森病(Parkinson’sdisease,PD)、亨廷顿病(Huntington’sDisease,HD)等一系列神经退行性疾病。这类疾病包括AD被统称为tau疾病(tauopathies)。高度磷酸化的Tau蛋白是引起这类疾病的重要原因，故也是这类疾病的重要治疗靶点。目前提出的多种基于tau蛋白的治疗提案主要集中在对tau蛋白的降解上。该方案之所以受青睐，主要基于下述原因：(1)大量的证据表明，降低细胞内tau蛋白的含量，在动物模型中甚少引起副作用；(2)降低tau蛋白的含量可抑制tau蛋白的聚集，而tau蛋白的聚集则是引起神经元退行性变的重要原因；(3)降低tau蛋白的含量可降低多种因素(比如Aβ)引起的神经元兴奋性神经毒性作用。因此，降低tau蛋白也被认为是一种新的潜在的治疗癫痫及中风的方案。降低细胞内靶蛋白常用的技术方法有两种。(1)用siRNA、miRNA或反义寡核苷酸降低靶蛋白的表达，由于这些寡核苷酸在组织中的分布不好，药物代谢动力学较差，加之有脱靶的可能性，目前其在临床的应用受到限制，还有待进一步改进；(2)增强靶蛋白的降解：常见的方法是增强蛋白降解系统包括蛋白酶系统及自噬系统的活性。但非特异性地增强蛋白降解系统的活性易引起其它非靶蛋白的降解而严重副作用，故目前尚未有激活蛋白降解系统的药物获批在临床应用。
技术实现思路
针对现有技术的如上缺陷，本专利技术的目的是构建一种促进tau蛋白去磷酸化的嵌合体(DEPhosorylation-TArgetingChimaeras，简称为DEPTAC嵌合体)，以对高度磷酸化的tau蛋白去磷酸化，从而抑制其功能。为了实现此目的，本专利技术的专利技术人通过深入研究发现，基于蛋白降解靶向嵌合体(PROteolysisTArgetingChimeras,DEPTAC)技术的相似原理，可以构建一种双功能蛋白嵌合体，其一端能特异结合靶蛋白(也即tau蛋白)，另一端特异结合特定的磷酸酯酶，两者之间经由连接序列(Linker)连接，并在特异结合特定的磷酸酯酶一端再连接穿膜肽序列。如此构建的蛋白嵌合体因能同时结合靶蛋白及磷酸酯酶，使靶蛋白临近磷酸酯酶，选择性诱导tau蛋白发生去磷酸化。而且，所述DEPTAC技术除了对靶蛋白的选择性，还有下面的优点：(1)能作用于许多传统难以成药的靶点。许多传统的小分子药物必须作用于靶蛋白的特定的结合口袋(bindingpockets)，才能发挥抑制作用。DEPTAC技术则没有这种限制，其只要能与靶蛋白的任何区段相互作用，并且无需很高的亲和力，即可导致靶蛋白的快速降解(本申请为对靶蛋白去磷酸化)从而抑制靶蛋白的功能，故能作用于许多传统难以成药的靶点。(2)DEPTAC技术在细胞内能被重复使用，能起到类似催化的效应，故无需很高浓度即可达到治疗效果。为此，第一方面，本专利技术提供了一种促进tau蛋白去磷酸化的嵌合体，该嵌合体包括tau蛋白结合序列、连接序列、磷酸酯酶募集序列和穿膜肽序列，所述tau蛋白结合序列与所述磷酸酯酶募集序列通过连接序列连接。在优选的实施方式中，所述磷酸酯酶为ABαC型磷酸酯酶2A。在优选的实施方式中，所述tau蛋白结合序列为β微管蛋白的第422-434片段；优选的，所述tau蛋白结合序列的氨基酸序列如SEQ.ID.NO:1所示。在优选的实施方式中，所述连接序列的氨基酸序列如SEQ.ID.NO:2所示。在优选的实施方式中，所述磷酸酯酶募集序列为全长人源性tau蛋白的第224-236片段；优选的，所述磷酸酯酶募集序列的氨基酸序列如SEQ.ID.NO:3所示。在优选的实施方式中，所述穿膜肽序列的氨基酸序列如SEQ.ID.NO:4所示。在优选的实施方式中，所述嵌合体的氨基酸序列如SEQ.ID.NO:5所示。第二方面，本专利技术提供了编码如上所述的促进tau蛋白去磷酸化的嵌合体的基因。在优选的实施方式中，所述基因的核苷酸序列如SEQ.ID.NO:6所示。第三方面，本专利技术提供了一种重组载体，该重组载体包括载体以及连接在所述载体上的如上所述的基因。在优选的实施方式中，所述载体为质粒或腺病毒载体，所述质粒优选为pIRES2-EGFP质粒，所述腺病毒载体优选为腺病毒AOV002载体；优选的，所述基因连接在腺病毒载体的EcoRI和BamHI酶切位点之间的读码框内。第四方面，本专利技术提供了如上所述的嵌合体、如上所述的基因或如上所述的重组载体在制备用于治疗和/或预防与tau蛋白有关的疾病的药物中的应用。可选地，所述疾病为阿尔茨海默病(AD)、连锁于17号染色体伴帕金森病的额颞叶痴呆(Frontotemporaldementialinkedtochromosome-17parkinsonism,FTDP-17)、皮克氏病(Pick’sdisease,PiD)、进行性核上麻痹(progressives本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种促进tau蛋白去磷酸化的嵌合体，其特征在于，该嵌合体包括tau蛋白结合序列、连接序列、磷酸酯酶募集序列和穿膜肽序列，所述tau蛋白结合序列与所述磷酸酯酶募集序列通过连接序列连接。

【技术特征摘要】
1.一种促进tau蛋白去磷酸化的嵌合体，其特征在于，该嵌合体包括tau蛋白结合序列、连接序列、磷酸酯酶募集序列和穿膜肽序列，所述tau蛋白结合序列与所述磷酸酯酶募集序列通过连接序列连接。2.根据权利要求1所述的嵌合体，其中，所述磷酸酯酶为ABαC型磷酸酯酶2A。3.根据权利要求1或2所述的嵌合体，其中，所述tau蛋白结合序列为β微管蛋白的第422-434片段；优选的，所述tau蛋白结合序列的氨基酸序列如SEQ.ID.NO:1所示。4.根据权利要求1或2所述的嵌合体，其中，所述连接序列的氨基酸序列如SEQ.ID.NO:2所示。5.根据权利要求1或2所述的嵌合体，其中，所述磷酸酯酶募集序列为全长人源性tau蛋白的第224-236片段；优选的，所述磷酸酯酶募集序列的氨基酸序列如SEQ.ID.NO:3所示。6.根据权利要求1或2所述的嵌合体，其中，所述穿膜肽序列的氨基酸序列如SEQ.ID.NO:4所示。7.根据权利要求1或2所述的嵌合体，其中，所述嵌合体的氨基酸序列如SEQ.ID.NO:5所示。8.编码权利要求1-7中任意一项所述的促进tau蛋白去磷酸化的嵌合体的基因；优选的，所述基因的核苷酸序列如SEQ.ID.NO:6所示。9...

【专利技术属性】
技术研发人员：王建枝，郑杰，
申请(专利权)人：华中科技大学，
类型：发明
国别省市：湖北,42