制备磷酸化丝氨酸膦酸模拟物的方法技术

本发明专利技术涉及制备磷酸化丝氨酸膦酸模拟物的方法，具体地，所述方法包括：(1)使式1所示化合物进行还原反应，以便获得式2所示化合物；(2)使所述式2所示化合物进行溴化反应，以便获得式3所示化合物；(3)使所述式3所示化合物与式4所示化合物进行接触，以便获得式5所示化合物；(4)使所述式5所示化合物脱保护基，以便获得式(I)所示化合物，其中，R为氢、苄基、邻硝基苄基、香豆素或烯丙基，R1为苄基、邻硝基苄基、香豆素或烯丙基。该方法所采用的原料便宜、易得，反应路线步骤较少，整条路线的总收率在20％以上，可以制备获得高产率高质量的磷酸化丝氨酸膦酸模拟物。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于生物化学合成领域，具体地，涉及制备磷酸化丝氨酸膦酸模拟物的方法及其应用。
技术介绍
蛋白质的磷酸化是一种非常重要的翻译后修饰，它与细胞代谢、信号传导、免疫识别和细胞凋亡等都有密切的关系，与磷酸化有关的酶也常常作为药物分子的靶向目标。然而磷酸化蛋白的研究(特别是体内实验)往往比较困难，其主要原因是磷酸化蛋白难以获得以及在细胞中容易被水解。随着重组表达技术和多肽固相合成技术的发展，以及诸如自然化学连接(NCL)、表达蛋白连接(EPL)等新技术的不断出现，获取磷酸化蛋白正在变得越来越方便；而对于磷酸化蛋白容易水解的问题，前人也开发了一系列模拟物代替天然的磷酸基团，而这些模拟物中效果最好的是以磷碳键模拟磷酸酯键的膦酸类化合物。膦酸模拟物具有与磷酸基结构高度类似，且可以在不被水解的情况下与磷酸水解酶等蛋白结合的优势；通过将其整合到蛋白中磷酸化的位点，就可以通过蛋白质体外结合的方式发现新的蛋白-蛋白相互作用，或者通过微注射的方式观察蛋白在细胞内的稳定性和空间分布情况，从而获得一些其它磷酸化蛋白模拟物难以做到的结果。目前，用膦酸模拟物代替磷酸化氨基酸的磷酸化多肽或蛋白模拟物主要由多肽固相合成法进行化学合成，而灵活性高、与侧链保护基兼容性好的Fmoc策略则是现有的多肽固相合成法的主流策略。然而，目前制备磷酸模拟物的方法仍有待改进。
技术实现思路
本专利技术旨在至少在一定程度上解决相关技术中的技术问题之一。根据本专利技术的第一方面，本专利技术提供了一种制备磷酸化丝氨酸膦酸模拟物的方法，包括：(1)使式1所示化合物进行还原反应，以便获得式2所示化合物；(2)使所述式2所示化合物进行卤化反应，以便获得式3所示化合物；(3)使所述式3所示化合物与式4所示化合物进行接触，以便获得式5所示化合物；(4)使所述式5所示化合物脱保护基，以便获得式(I)所示化合物，其中，R为氢、苄基、邻硝基苄基、香豆素或烯丙基，R1为苄基、邻硝基苄基、香豆素或烯丙基等正交保护基，该方法主要是由保护的天然氨基酸N-叔丁氧羰基-天冬氨酸叔丁酯(Boc-Asp-OtBu)经过还原、溴代、亚磷酸酯取代和脱保护，从而获得磷酸化丝氨酸膦酸模拟物，该方法所采用的原料便宜、易得，反应路线步骤较少，整条路线的总收率在20％以上，可以制备获得高产率高质量的磷酸化丝氨酸膦酸模拟物。利用该方法制备获得的磷酸化丝氨酸膦酸模拟物可以通过多肽固相合成法得到含有磷酸化丝氨酸膦酸模拟物的多肽或蛋白质，可以在细胞内很好地模拟多肽或蛋白中磷酸化丝氨酸的行为而且不会被磷酸水解酶水解，在磷酸化蛋白质研究及抑制剂开发方面具有重要意义。根据本专利技术的一些实施例，步骤(1)包括：(1-1)在乙酸乙酯中，存在二环己基碳二亚胺的情况下，使所述式1所示化合物与N-羟基琥珀酰亚胺接触，以便获得式1所示化合物的N-羟基琥珀酰亚胺活化酯；(1-2)在1,4-二氧六环中，使所述式1所示化合物的N-羟基琥珀酰亚胺活化酯与硼氢化钠接触，以便获得所述式2所示化合物。式1所示化合物的N-羟基琥珀酰亚胺活化酯中间体无需分离纯化，可以直接用于硼氢化钠还原。根据本专利技术的具体实施例，步骤(1)包括：将式1所示化合物与N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)溶于乙酸乙酯，并加入二环己基碳二亚胺(DCC)，室温下搅拌反应过夜得到式1所示化合物的NHS活化酯，过滤除去不溶物并浓缩滤液，剩余物溶于1,4-二氧六环并加入硼氢化钠，冰浴并滴加少量水引发反应后继续室温反应2小时，用饱和氯化铵溶液淬灭反应，浓缩除去二氧六环后用乙酸乙酯提取，有机相合并后用水和饱和食盐水洗涤，干燥后浓缩并用柱色谱分离，得到式2所示化合物。根据本专利技术的具体实施例，步骤(1)中活化酯还原过程反应时间应依据TLC薄层色谱监测的结果进行相应调整，采用乙酸乙酯和环己烷的混合溶液为展开剂时，式2所示化合物的Rf值约为0.7，其中，乙酸乙酯和环己烷混合溶液中乙酸乙酯和环己烷的体积比为1:1。根据本专利技术的具体实施例，步骤(1)中柱色谱分离所采用的展开剂为乙酸乙酯和环己烷的混合溶液，其中乙酸乙酯和环己烷溶液中乙酸乙酯和环己烷的体积比为1:3。根据本专利技术的一些实施例，步骤(2)中，所述卤化反应为碘化反应或溴化反应。根据本专利技术的一些实施例，步骤(2)中采用Appel反应进行溴化反应，由此可以进一步地提高收率。根据本专利技术的一些实施例，步骤(2)包括：在二氯甲烷中，存在三苯基膦的情况下，使所述式2所示化合物与N-溴代琥珀酰亚胺接触，以便获得所述式3所示化合物。根据本专利技术的具体实施例，步骤(2)包括：将所述式2所示化合物溶于二氯甲烷，加入N-溴代琥珀酰亚胺(NBS)并搅拌分散均匀，在冰浴上向上述混合物中滴加三苯基膦的二氯甲烷溶液，加完后继续室温反应2小时。用水淬灭反应，分出有机相并用二氯甲烷提取水相，提取液与有机相合并后用水和饱和食盐水洗涤，干燥后浓缩并用柱色谱分离，得到所述式2所示化合物。根据本专利技术的具体实施例，步骤(2)中采用无水处理后的二氯甲烷。由此，可以提高收率。根据本专利技术的具体实施例，步骤(2)中反应时间应依据TLC薄层色谱监测的结果进行相应调整，使用乙酸乙酯和环己烷的混合溶液作为展开剂时，式3所示化合物的Rf值约为0.6，其中，乙酸乙酯和环己烷的混合溶液中乙酸乙酯和环己烷的体积比为1:4。根据本专利技术的具体实施例，步骤(2)中柱色谱分离所采用的展开剂为乙酸乙酯和环己烷的混合溶液，其中，乙酸乙酯和环己烷的混合溶液中乙酸乙酯和环己烷的体积比为1:7。根据本专利技术的一些实施例，步骤(3)包括：于惰性气体条件下，在乙腈溶液中，存在DBU的情况下，使所述式3所示化合物与所述式4所示化合物进行接触，以便获得所述式5所示化合物。其中，需要说明的是，DBU为1,8-二氮杂二环十一碳-7-烯。根据本专利技术的具体实施例，步骤(3)包括：在惰性气体保护下，向亚磷酸二苄酯的无水乙腈溶液中加入式3所示化合物，然后在冰浴上搅拌滴加DBU，继续室温反应8小时。反应结束后，用环己烷洗去杂质，乙腈相浓缩并用柱色谱分离，得到2-(叔丁氧羰基氨基)-4-(二苄基膦酸基)丁酸叔丁酯((Boc-Pma(Bn)2-OtBu)。根据本专利技术的具体实施例，步骤(3)中反应需要在无水无氧的条件下进行。由此，可以提高收率。根据本专利技术的具体实施例，步骤(3)中反应时间应依据TLC薄层色谱监测的结果进行相应调整，使用乙酸乙酯和环己烷混合溶液作为展开剂时，2-(叔丁氧羰基氨基)-4-(二苄基膦酸基)丁酸叔丁酯((Boc-Pma(Bn)2-OtBu)的Rf值约为0.5，其中，乙酸乙酯和环己烷混合溶液中乙酸乙酯和环己烷的体积比为1:1。根据本专利技术的具体实施例，步骤(3)中若使用亚磷酸二(邻硝基苄醇)酯代替亚磷酸二苄酯，得到2-(叔丁氧羰基氨基)-4-(二邻硝基苄基膦酸基)丁酸叔丁酯，并且反应和后处理过程中应避光。根据本专利技术的具体实施例，步骤(3)中柱色谱分离使用的展开剂为乙酸乙酯和环己烷的混合溶液，其中，乙酸乙酯和环己烷的混合溶液中乙酸乙酯和环己烷的体积比为1:2。根据本专利技术的一些实施例，步骤(4)包括：使所述式5所示化合物于三氟乙酸-水-三乙基硅烷混合体系中进行反应，以便获得所述式(I)所示化合物。由此，根据本专利技术的具体实施例，本专利技术提出了以下合成本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种制备磷酸化丝氨酸膦酸模拟物的方法，其特征在于，包括：(1)使式1所示化合物进行还原反应，以便获得式2所示化合物；(2)使所述式2所示化合物进行卤化反应，以便获得式3所示化合物；(3)使所述式3所示化合物与式4所示化合物进行接触，以便获得式5所示化合物；(4)使所述式5所示化合物脱保护基，以便获得式(I)所示化合物，其中，R为氢、苄基、邻硝基苄基、香豆素或烯丙基，R1为苄基、邻硝基苄基、香豆素或烯丙基，

【技术特征摘要】
1.一种制备磷酸化丝氨酸膦酸模拟物的方法，其特征在于，包括：(1)使式1所示化合物进行还原反应，以便获得式2所示化合物；(2)使所述式2所示化合物进行卤化反应，以便获得式3所示化合物；(3)使所述式3所示化合物与式4所示化合物进行接触，以便获得式5所示化合物；(4)使所述式5所示化合物脱保护基，以便获得式(I)所示化合物，其中，R为氢、苄基、邻硝基苄基、香豆素或烯丙基，R1为苄基、邻硝基苄基、香豆素或烯丙基，2.根据权利要求1所述方法，其特征在于，步骤(1)包括：(1-1)在乙酸乙酯中，存在二环己基碳二亚胺的情况下，使所述式1所示化合物与N-羟基琥珀酰亚胺接触，以便获得式1所示化合物的N-羟基琥珀酰亚胺活化酯；(1-2)在1,4-二氧六环中，使所述式1所示化合物的N-羟基琥珀酰亚胺活化酯与硼氢化钠接触，以便获得所述式2所示化合物。3.根据权利要求1所述方法，其特征在于，步骤(2)中，所述卤化反应为碘化反应或溴化反应。4.根据权利要求3所述方法，其特征在于，步骤(2)中，采用Appel反应进行溴...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈永湘，陈弘学，康捷，黄思奇，张思煜，李方翊，李艳梅，
申请(专利权)人：清华大学，
类型：发明
国别省市：北京;11