本发明专利技术涉及一种Oct蛋白的磷酸化位点及抗磷酸化Oct4蛋白的抗体，具体讲，涉及Oct4蛋白343位磷酸化及一种针对Oct4蛋白343位磷酸化的抗体。所述的抗体的为单克隆抗体或多克隆抗体。本发明专利技术还涉及抗体用于检测Oct4蛋白343位苏氨酸的磷酸化的应用。当Oct4蛋白343位苏氨酸的磷酸化时，Oct4蛋白对下游基因Nanong、Sox2的正向调控能力下降，从而失去维持干细胞自我复制及多潜能分化的能力。所述的应用包括所述的抗体在检测干细胞增殖、细胞分化、干细胞多潜能性、干细胞自我复制能力中的应用。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种抗磷酸化0ct4蛋白的抗体,具体讲,涉及一种针对0ct4蛋白343位磷酸化的抗体。
技术介绍
干细胞按分化能力分为全能性、 多能性和专能性干细胞。0ct4是全能性或多能干细胞标记物，在胚胎干细胞、胚胎生殖细胞和胚胎/生殖细胞肿瘤中阳性表达，但在分化的组织中均表达降低或消失，提示其在胚胎干细胞、生殖细胞和胚胎/生殖肿瘤中的表达与这些细胞的多能性分化特性密切相关。在成体组织和体细胞肿瘤中亦发现0ct4阳性表达。迄今为止，0ct4在成体组织中的表达主要局限于具有干细胞特性的细胞，如皮肤基底细胞层中的个别细胞、乳腺干细胞和胃干细胞等。0ct4 mRNA及其蛋白质在未受精的卵母细胞中出现，也在桑椹胚期(32 64个细胞)的所有胚胎细胞中有丰富表达。进一步研究发现，0ct4在原肠胚前期的胚胎外胚层亦有表达。因此被认为是胚胎干细胞和生殖细胞的标记物。研究证实，内细胞群0ct4表达比分化的滋养外胚层细胞高31倍，与鼠类相同。因此，在植入前的桑椹胚阶段决定0ct4在内细胞群表达，在周围滋养层中表达下调的机制对植入前胚胎的正常发育具有关键作用。在桑椹胚阶段，0ct4表达使每个细胞都具有全能性。滋养层细胞形成过程是0ct4表达下降致细胞分化的结果，细胞失去全能性，分化为滋养层细胞利于胚泡进行子宫内膜植入。可见，0ct4在内细胞群持续表达和滋养层表达下降是形成不同的分工共同维持胚胎发育。0ct4在胚胎生殖细胞中表达出现在睾丸生殖细胞的孕17 37周，高峰出现在性腺发育的孕17 24周。出生后睾丸曲精小管无阳性表达。此期可能是睾丸胚胎生殖细胞数最多时，而后逐渐向其他组织分化，形成睾丸的各种结构。最近，在羊水中发现有0ct4表达阳性的细胞，该细胞有活跃的分裂能力。因为被证实在细胞增殖时才表达的细胞周期调节剂cyclin A在这些细胞中表达。由于有三个胚层起源的不同胚胎/胎儿细胞存在于羊水中，要搞清这些阳性羊水细胞的细胞起源尚需进一步研究。相对胚胎干细胞和生殖细胞而言，0ct4的表达在所有类型的分化细胞中均下降。Solter发现在排出的卵母细胞、小鼠植入前胚胎细胞、原胚腔的外胚层、原生殖细胞和胚胎干细胞中均有0ct4表达，而当这些细胞进入分化状态后其表达消失。在4 8个胚胎细胞组成的胚泡中，不同水平的0ct4表达预示胚泡或向内细胞群发育，或向滋养外胚层发育。0ct4在原肠胚形成前期的全能和多分化潜能细胞中表达，在分化成内胚层和中胚层过程中下调。同样，Yeom等也发现在鼠原肠胚形成前期的胚胎全能性细胞产生的各种胚胎体细胞组织和生殖细胞中均表达0ct4。此种表达在原肠胚期呈下降调节，此后仅维持在种系中表达。因此，高水平的0ct4表达认为与维持细胞全能性相关，而0ct4表达的下调认为与分化有关。0ct4通过结合位于转录起始点近侧或远侧的八聚体基序来激活转录，在胚胎发育过程中起重要作用。0ct4缺陷的小鼠胚胎迅速死去，不能引发胚胎发育。原因是缺少内细胞群形成，胚胎全能性细胞不能进行维持发育和自我修复。与基础表达水平相比，小于两倍的0ct4表达就可使胚胎全能性细胞分化成原始的内胚层和中胚层，而抑制其表达致使胚胎全能性细胞分化成滋养外胚层综上所述，0ct4是胚胎早期发育过程中重要的决定和保护因素，其表达情况直接决定胚胎发育结果。0ct4是参与调控胚胎干细胞自我更新和维持其全能性的最为重要的转录因子之一，同时也是体外建立诱导多功能干细胞(iPS)的关键基因。在全能胚胎干细胞和生殖系干细胞表达。在早期胚胎中，在ICM阶段，0ct4为维持其全能性而发挥作用。传统认为0ct4的激活有3种模式远端依赖性共激活，构象依赖性共激活，0ct4聚合体依赖性共激活。在本专利技术中，专利技术人提出了一种新的激活模式，即磷酸化依赖性激活。
技术实现思路
本专利技术首先发现0ct4蛋白的C末端的343位苏氨酸残基是一个新的磷酸化位点，此位点的磷酸化决定了 0ct4作为转录因子对下游基因的调控，即343位苏氨酸残基突变为丙氨酸残基时，0ct4对下游基因Nanong、Sox2的正向调控能力下降，因而失去维持干细胞自我复制及多潜能分化的能力。 本专利技术的首要专利技术目的在于提出抗磷酸化0ct4蛋白的抗体。本专利技术的第二专利技术目的在于提出这种抗体的应用。为了实现本专利技术的第一专利技术目的，采用的技术方案为本专利技术涉及一种抗磷酸化0ct4蛋白的抗体,所述的抗体是针对0ct4蛋白343位磷酸化的抗体。本专利技术的第一优选技术方案为所述的抗体的为单克隆抗体或多克隆抗体。本专利技术的第二优选技术方案为所述单克隆抗体的制备方法包括以下步骤⑴合成多肽合成第8位氨基酸磷酸化的多肽SEQ ID NO 1 50mg,非磷酸化的多肽SEQ ID NO 1 20mg ；SEQ ID NO : I 的氛基酸序列为Ala-Phe-Pro-Ser-Val-Pro-Val-Thr-Ala-Leu-Gly-Ser-Pro-Met-Hi s ；第8位氨基酸磷酸化的SEQ ID NO 1的氨基酸序列为Ala-Phe-Pro-Ser-Val-Pro-Val-p-Thr-AlaLeu-Gly-Ser-Pro-Met-His ；⑵血清阶段兔子经过5次免疫后，取全血，析出血清，检测血清的滴度，筛选出特异性较强的免疫兔；(3)细胞融合筛选出的兔子的脾细胞与小鼠SP2/0细胞进行融合；(4)初筛脾细胞融合后14 18天，筛选阳性克隆进行细胞培养；(5)复筛将孔板的上清进行ELISA复筛，复筛时，分别使用第8位氨基酸磷酸化的多肽SEQID NO :1和非磷酸化的多肽SEQ ID NO 1包被反应板，将血清添加入反应板进行抗原抗体反应，与磷酸化的多肽反应阳性而非磷酸化的多肽反应阴性克隆继续维护，得到上清中抗体与抗原反应的特异性的阳性克隆；(6)腹水制备在细胞株鉴定合格后，收集合格杂交瘤细胞稀释后对鼠进行腹腔注射；5_7天后取腹水，取腹水后置4°C过夜，离心、取上清获得单克隆抗体。本专利技术的第二优选技术方案为所 述的多克隆抗体的制备方法包括以下步骤(I)多肽合成合成磷酸化的多肽 第10位氨基酸磷酸化的SEQ ID NO 2 15mg，非磷酸化的多肽SEQID NO 2 Ilmg ；其中SEQ ID NO 2 的氨基酸序列为Gly-Glu-Ala-Phe-Pro-Ser-Val-Pro-Val_Thr-Ala-Leu-GlySer-Pro ;第10位氨基酸磷酸化的SEQ ID NO 2的氨基酸序列为Gly-Glu-Ala-Phe-Pro-Ser-Val-Pro-Val-p-Thr-Ala-Leu-Gly-Ser-Pro ；(2)动物免疫选用健康家兔2只，经过5ml/只、5次免疫后，收集血清50_70ml/只；(3)免疫血清的鉴定利用10ug/ml抗原包被，ELISA的方法鉴定血清的效价及特异性。为了实现本专利技术的第二专利技术目的，采用的技术方案为本专利技术还涉及该抗体在检测0ct4蛋白343位苏氨酸的磷酸化的应用。本专利技术的第一优选技术方案为当0ct4蛋白343位苏氨酸的磷酸化时，0ct4蛋白对下游基因Nanong、Sox2的正向调控能力下降，从而失去维持干细胞自我复制及多潜能分化的能力。本专利技术的第二优选技术方案为所述的应用包括所述的抗体在检测干细胞增殖本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种抗磷酸化Oct4蛋白的抗体，其特征在于，所述的抗体是针对Oct4蛋白343位氨基酸磷酸化的抗体。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：李凌松，文锦华，
申请(专利权)人：李凌松，文锦华，
类型：发明
国别省市：
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