表达于T淋巴细胞表面的嵌合抗原受体及其应用制造技术

本发明专利技术提供表达于T淋巴细胞表面的嵌合抗原受体及其应用，所述嵌合抗原受体包括顺序连接的：胞外结合区，铰链区和胞内信号区，其中所述胞外结合区包含特异性识别MUC1和NKG2D配体的蛋白。所述嵌合抗原受体表达于T淋巴细胞表面，具有同时特异性识别MUC1和NKG2D配体的蛋白的效果。

Chimeric antigen receptor expressed on T lymphocyte surface and its application

The present invention provides chimeric antigen receptors expressed on T lymphocyte surfaces and their applications. The chimeric antigen receptors include sequentially connected extracellular binding regions, hinge regions and intracellular signal regions, wherein the extracellular binding regions contain proteins specifically recognizing MUC1 and NKG2D ligands. The chimeric antigen receptor is expressed on the surface of T lymphocyte, and has the effect of simultaneously and specifically recognizing the proteins of MUC1 and NKG2D ligands.

【技术实现步骤摘要】
表达于T淋巴细胞表面的嵌合抗原受体及其应用
本专利技术涉及基因修饰细胞及肿瘤治疗
，尤其涉及表达于T淋巴细胞表面的嵌合抗原受体及其应用。
技术介绍
CAR-T疗法，全称是ChimericAntigenReceptorT-CellImmunotherapy，嵌合抗原受体T细胞免疫疗法。其主要原理是，从癌症病人身上分离免疫T细胞，利用基因工程技术为T细胞引入一个能够识别肿瘤细胞并同时激活T细胞的嵌合抗体，也就是制备CAR-T细胞，再将扩增好的CAR-T细胞回输到病人体内，通过免疫疗法对抗癌细胞。嵌合抗原受体(ChimericAntigenReceptor，CAR)主要由两部分构成，一端位于细胞外，能够特异性识别癌细胞表面的某一抗原；另一端位于胞内，含有信号激活元件(如T细胞受体的Zeta链)，起传递信号激活T细胞的作用。这样表达CAR的T淋巴细胞(CAR-T细胞)就能避免T细胞受体识别靶细胞的限制，从而起到靶向癌细胞的的杀伤作用。目前诺华公司针对治疗罹患B细胞前体急性淋巴性白血病的CAR-T细胞CTL019已经上市，会让不少患者受益，但是仍有不少患者因白血病复发和难治而去世。Zah等报道了以CD19和CD20为双向靶点设计出新型CAR-T，提高了杀伤效果，降低复发的可能性。另外，CAR-T疗法还存在缺乏足够的持久性、抗原逃逸会导致复发等问题，这就需要研究者们研发更为有效的CAR-T细胞。Mucin1是膜结合型粘蛋白家族成员，简称MUC1。在正常情况下，MUC1呈低水平表达在乳腺，胰腺，胃肠道，呼吸道及泌尿生殖道的上皮细胞的近管腔面，不能被机体免疫系统识别，其表达特点为极性表达，顶端分布，糖基化丰富。MUC1在肿瘤细胞中过表达并失去极性，成为肿瘤相关的MUC1，重新分布在细胞表面以及细胞浆。大量研究表明，很多与肿瘤增殖、转移、侵袭、血管生成、凋亡、药物抵抗和免疫调节相关的基因的转录调节与MUC1的表达密切相关。因此，MUC1能通过调控多种信号通路调节细胞效应，是促进肿瘤发生发展的重要癌基因。最近一个调查研究表明，在75个发展癌症疫苗的肿瘤相关抗原中，MUC1是排名第二的潜在靶点。由于在大多数腺癌、血液系恶性肿瘤中MUC1呈异常过表达，糖基化不全，并失去极性，遍布于整个细胞表面，使其成为肿瘤标志物，可被免疫系统识别，因此，MUC1蛋白可作为CAR-T细胞抗肿瘤治疗的一个理想靶点。NKG2D是一种II型跨膜糖蛋白，通过二硫键形成同源二聚体的形式表达于细胞表面，胞外区含1个C型凝集素样区域，因此，通常被称作C-型凝集素样受体同源二聚体。几乎所有的自然杀伤(naturalkiller，NK)细胞表面(包括人类和鼠类)表达NKG2D。人类的CD8+T细胞天然表达NKG2D，NKG2D也表达在自然杀伤T细胞(naturalkillerTcell，NKT)、γδT细胞、CD4+T细胞的一部分亚群。人类NKG2D的配体主要有组织相容性复合体I类链相关蛋白A/B(majorhistocompatibilitycomplexclassIchain-relatedproteinA/B，MICA/B)和人巨细胞病毒UL16结合蛋白(HCMVUL16-bindingprotein，ULBP)。一般认为，NKG2D配体的表达是细胞处于“应激状态”的一个指标，例如病毒感染和恶性转化时，但很少会出现在健康细胞的表面。NKG2D配体几乎在人体所有组织来源的肿瘤细胞上有不同程度的表达。许多上皮来源的癌细胞、恶性黑色素瘤细胞及多种类型的白血病细胞表达MICA。另外，MICA、MICB表达于原发性肝细胞癌，且与肝癌细胞对NK细胞的敏感性有关。原发性白血病、恶性黑色素瘤和神经胶质瘤来源的肿瘤细胞表达ULBP分子。由于NKG2D能够识别肿瘤细胞上相应的配体，而NKG2D配体的表达作为机体发生肿瘤时肿瘤细胞上的一个特异性的改变，因此，NKG2D配体为肿瘤的免疫治疗提供了一个更为精确的靶点，也为肿瘤新的免疫治疗方法的开发及应用提供方向和思路。近年来，设计表达NKG2D的CAR修饰T细胞能够特异性识别NKG2D配体阳性的肿瘤细胞，诱导肿瘤裂解，并获得较好的预后。这种嵌合NKG2D的CAR是由活化性受体NKG2D与CD3ζ融合组成，表达于T淋巴细胞表面；其胞质区的CD3ζ能够与接头蛋白DAP10结合，进行信号传导。嵌合NKG2D的CAR修饰T细胞活化后，溶解NKG2D配体阳性的肿瘤细胞，并分泌促炎性细胞因子，发挥其强大的细胞毒作用。目前还没有能同时靶向MUC1和NKG2D配体的CAR-T细胞。
技术实现思路
本专利技术提供一种表达于T淋巴细胞表面的嵌合抗原受体，能特异性识别MUC1和NKG2D配体。本专利技术还提供了编码所述嵌合抗原受体的核酸，包含所述核酸的表达载体，以及包含所述表达载体的病毒。本专利技术还提供了所述核酸，或所述表达载体，或所述病毒的用途，用于制备靶向MUC1和NKG2D配体的基因修饰的T淋巴细胞。本专利技术还提供了一种基因修饰的T淋巴细胞，其表面表达所述的嵌合抗原受体，使得所述T淋巴细胞能靶向MUC1和NKG2D配体。本专利技术还提供了所述的基因修饰的T淋巴细胞的用途，用于制备抑制肿瘤的药物，所述肿瘤是MUC1和NKG2D配体阳性的肿瘤。本专利技术提供的表达于T淋巴细胞表面的嵌合抗原受体，所述嵌合抗原受体包括顺序连接的：胞外结合区，铰链区和胞内信号区，其中所述胞外结合区包含特异性识别MUC1和NKG2D配体的蛋白。进一步的，所述胞外结合区为特异性识别MUC1蛋白的SCFV与特异性识别NKG2D配体的NKG2D即SCFV-NKG2D，所述铰链区为IgD，所述胞内信号区为CD28–4-1BB–CD3ζ。更进一步的，所述嵌合抗原受体具有SEQIDNO:1所述的氨基酸序列。本专利技术还提供了编码所述嵌合抗原受体的核酸。在本专利技术的一个具体实施方式中，所述核酸具有SEQIDNO:2所述的核苷酸序列。在本专利技术的一个具体实施方式中，所述表达载体来源于慢病毒质粒，例如pGreenpuro。本专利技术提供的一种基因修饰的T淋巴细胞，其转导有所述的核酸、或所述的表达载体或所述的病毒。本专利技术提供的一种基因修饰的T淋巴细胞，其表面表达一种嵌合抗原受体，所述嵌合抗原受体具有SEQIDNO:1所述的氨基酸序列。本专利技术还提供了所述的基因修饰的T淋巴细胞的用途，用于制备抑制肿瘤的药物，所述肿瘤是MUC1和NKG2D配体阳性的肿瘤。本专利技术方案具有以下优点：1)本专利技术提供的基因修饰的T淋巴细胞，能够特异性识别和高效杀伤MUC1和NKG2D配体阳性的肿瘤。附图说明图1显示了识别MUC1的嵌合抗原受体，以及识别MUC1和NKG2D配体的嵌合抗原受体的设计示意图。图2显示了本专利技术提供基因修饰的T淋巴细胞在体外对乳腺癌细胞系MCF-7的杀伤效果。图3显示了本专利技术提供基因修饰的T淋巴细胞在体外对胰腺癌细胞系BxPC-3的杀伤效果。图4显示了本专利技术提供基因修饰的T淋巴细胞在体内治疗肿瘤效果。图5显示了慢病毒表达载体pGreenpuro的结构示意图。具体实施方式实施例1靶向MUC1和NKG2D配体的T淋巴细胞、靶向MUC1的T淋巴细胞的制备1.合成和扩增1)合成编码本专利技术靶向MUC1和NKG2D配体的嵌合抗原受本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.表达于T淋巴细胞表面的嵌合抗原受体，其特征在于，所述嵌合抗原受体包括顺序连接的：胞外结合区，铰链区和胞内信号区，其中所述胞外结合区包含特异性识别MUC1和NKG2D配体的蛋白。

【技术特征摘要】
1.表达于T淋巴细胞表面的嵌合抗原受体，其特征在于，所述嵌合抗原受体包括顺序连接的：胞外结合区，铰链区和胞内信号区，其中所述胞外结合区包含特异性识别MUC1和NKG2D配体的蛋白。2.如权利要求1所述的嵌合抗原受体，其特征在于，所述胞外结合区为特异性识别MUC1蛋白的SCFV与特异性识别NKG2D配体的NKG2D即SCFV-NKG2D，所述铰链区为IgD，所述胞内信号区为CD28–4-1BB–CD3ζ。3.如权利要求1所述的嵌合抗原受体，其特征在于，所述嵌合抗原受体具有SEQIDNO:1所述的氨基酸序列。4.编码权利要求1-3任一项所述嵌合抗原受体的核酸。5.如权利要求4所述的核酸，其特征在于，所述核酸具有SEQIDNO:2所述的核苷酸序列。6.一种表达载体，其特征在于，其包含权利要求4或5所述...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘未斌，刘曲波，李琼书，胡源，
申请(专利权)人：深圳市芥至和生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：广东,44