本发明专利技术提供表达于T淋巴细胞表面的嵌合抗原受体组合及其应用，所述包括嵌合抗原受体1即Anti MUC1 synNotch具有如下顺序连接的三个部分：特异性识别MUC1蛋白的SCFV、Notch core和转录因子Gal4‑VP64；以及嵌合抗原受体2即Anti CD19 CAR具有如下的顺序连接的胞外结合区，铰链区和胞内信号区：特异性识别CD19蛋白的SCFV，IgD，CD28–4‑1BB–CD3ζ。所述嵌合抗原受体组合表达于T淋巴细胞表面，具有特异性识别MUC1和CD19蛋白的效果。
Chimeric Antigen Receptor Combination Expressed on T Lymphocyte Surface and Its Application
The present invention provides chimeric antigen receptor combinations expressed on T lymphocyte surface and their applications. The chimeric antigen receptor 1, namely Anti MUC1 synNotch, has three sequential links: SCFV, Notch core and transcription factor Gal4_VP64 specifically recognizing MUC1 protein; and chimeric antigen receptor 2, Anti CD19 CAR, has the following sequence-linked extracellular binding regions. Hinge region and intracellular signal region: SCFV, IgD, CD28-4 1BB-CD3, which specifically recognize CD19 protein. The chimeric antigen receptor combination is expressed on the surface of T lymphocyte and has the effect of specifically recognizing MUC1 and CD19 proteins.
【技术实现步骤摘要】
表达于T淋巴细胞表面的嵌合抗原受体组合及其应用
本专利技术涉及基因修饰细胞及肿瘤治疗
，尤其涉及表达于T淋巴细胞表面的嵌合抗原受体组合及其应用。
技术介绍
近年来发展的利用基因改造技术表达肿瘤特异性嵌合抗原受体(chimericantigenreceptor，CAR)的T细胞显示出的靶向性、杀伤活性和持久性为过继性细胞免疫治疗注入了新的解决方案。嵌合抗原受体(ChimericAntigenReceptor，CAR)主要由两部分构成，一端位于细胞外，能够特异性识别癌细胞表面的某一抗原；另一端位于胞内，含有信号激活元件(如T细胞受体的Zeta链)，起传递信号激活T细胞的作用。这样表达CAR的T淋巴细胞(CAR-T细胞)就能避免T细胞受体识别靶细胞的限制，从而起到靶向癌细胞的杀伤作用。第一代CAR-T细胞的临床研究源自治疗B细胞恶性肿瘤(通过靶向CD20或CD19抗原)显示出该方法的可行性；然而这些加工过的细胞缺乏显著的抗肿瘤活性，可能是因为CAR-T细胞的持久性不足。第二代和第三代CAR设计采用一个或两个共刺激信号域。临床研究显示第二代CAR提高了体内转染T细胞的作用范围和持久性。第三代CAR包含两个共刺激结构域。第四代“装甲”CAR-T细胞额外表达细胞因子或共刺激配体，其目的是增强CAR-T细胞的扩增和寿命。CAR-T细胞识别抗原不受MHC限制，目前，CAR-T细胞技术在白血病、淋巴瘤、黑色素瘤、脑胶质瘤等恶性肿瘤治疗中均显示出良好的抗肿瘤效应。Mucin1是膜结合型粘蛋白家族成员，简称MUC1。人类MUC1基因是第一个被克隆的黏蛋白基因，定位于人1q21，包含七个exons，其编码产物是一种高分子量糖蛋白(＞200kD)，糖链占整个粘蛋白含量的50％以上,且多以O-糖苷键与多肽骨架上的Ser/Thr相连。正常情况下，MUC1粘蛋白呈低水平表达于乳腺，胰腺，胃肠道，呼吸道及泌尿生殖道的分泌上皮细胞的近管腔面，呈顶端表达，极性分布。在大多数腺癌、血液系恶性肿瘤及上皮组织的炎性疾病中，MUC1呈异常过表达，并失去极性，遍布于整个细胞表面，可通过调控多个信号通路调节细胞恶性转化，是促进肿瘤发生与发展的重要癌基因。因此，MUC1蛋白可作为CAR-T细胞抗肿瘤治疗的一个理想靶点。CD19是正常和恶性B淋巴细胞特异性表面蛋白，在B细胞的发育、增殖和分化以及恶性转化中发挥重要作用。因CD19在B淋巴细胞表达的特异性和恶性肿瘤表达的广泛性，使其成为一个颇具潜力的B淋巴细胞恶性肿瘤免疫治疗的分子靶点受到极大的关注。首先，CD19只在正常和恶性B细胞表达，几乎不在其他组织表达；其次，CD19在B细胞恶性转化过程中不丢失，难治/复发性病例仍然有效；再者，CD19在造血干细胞和pro-B细胞不表达，治疗停止后，B细胞可以得到有效地补充。基于良好的临床前和临床研究结果，靶向CD19的CAR修饰T细胞(CAR-T)产品已获FDA批准上市。值得注意的是，CAR-T疗法最大的临床风险就是细胞因子风暴。细胞因子风暴是由于CAR-T细胞杀伤B细胞后导致肿瘤细胞溶解所致，由于CAR-T的杀瘤作用在局部产生超大量的细胞因子，引起过强的免疫反应，导致炎症反应综合征，甚至危及生命。所以如何精细调控细胞因子的释放速度和水平，在保证CAR-T细胞杀伤活性的基础上，避免出现细胞因子风暴非常关键。
技术实现思路
本专利技术提供一种表达于T淋巴细胞表面的嵌合抗原受体组合，使得所述T淋巴细胞能特异性识别MUC1和CD19。本专利技术还提供了编码所述嵌合抗原受体组合的核酸，包含所述核酸的表达载体，以及包含所述表达载体的病毒。本专利技术还提供了所述嵌合抗原受体组合，或所述核酸，或所述表达载体，或所述病毒的用途，用于制备靶向MUC1和CD19的基因修饰的T淋巴细胞。本专利技术还提供了一种基因修饰的T淋巴细胞，其表面表达所述的嵌合抗原受体组合，使得所述T淋巴细胞能靶向MUC1和CD19。本专利技术还提供了所述的基因修饰的T淋巴细胞的用途，用于制备抑制肿瘤的药物，所述肿瘤是MUC1和CD19阳性的肿瘤。本专利技术提供的表达于T淋巴细胞表面的嵌合抗原受体组合，包括嵌合抗原受体1即AntiMUC1synNotch具有如下顺序连接的三个部分：特异性识别MUC1蛋白的SCFV、Notchcore(即Notch信号核心元件)和转录因子Gal4-VP64；以及嵌合抗原受体2即AntiCD19CAR具有如下的顺序连接的胞外结合区，铰链区和胞内信号区：特异性识别CD19蛋白的SCFV，IgD，CD28–4-1BB–CD3ζ进一步的，所述嵌合抗原受体1具有SEQIDNO:1所述的氨基酸序列。更进一步的，所述嵌合抗原受体2具有SEQIDNO:2所述的氨基酸序列。在本专利技术的一个具体实施方式中，编码所述嵌合抗原受体1核苷酸序列具有SEQIDNO:3所述的核苷酸序列，编码所述嵌合抗原受体2核苷酸序列具有SEQIDNO:4所述的核苷酸序列。在本专利技术的一个具体实施方式中，所述表达载体来源于慢病毒质粒，例如pGreenpuro。本专利技术提供的一种基因修饰的T淋巴细胞，其转导有所述的核酸、或所述的表达载体或所述的病毒。本专利技术提供的一种基因修饰的T淋巴细胞，其表面表达嵌合抗原受体组合，所述嵌合抗原受体组合包括具有SEQIDNO:1所述的氨基酸序列的所述嵌合抗原受体1以及具有SEQIDNO:2所述的氨基酸序列的所述嵌合抗原受体2。本专利技术还提供了所述的基因修饰的T淋巴细胞的用途，用于制备抑制肿瘤的药物，所述肿瘤是MUC1和CD19阳性的肿瘤。本专利技术还提供了制备本专利技术所述的基因修饰的T淋巴细胞的方法，包括：慢病毒质粒载体的构建，慢病毒的包装，慢病毒的纯化，CD8+T淋巴细胞的分离，靶向MUC1和CD19的T淋巴细胞的制备。其中，慢病毒质粒载体的构建：使用慢病毒表达载体pGreenpuro，将酶切位点XbaI和BamHI、转录因子Gal4-VP64的结合序列，以及EF1启动子，酶切位点NheI和EcoRI插入到慢病毒表达载体pGreenpuro的CMV启动子后面，获得改造后的慢病毒表达载体pGreenpuro。这对于本领域技术人员来说是可以通过常规手段实现的。SEQIDNO:3(编码所述嵌合抗原受体1的核苷酸序列)通过XbaI和BamHI酶切位点连到该载体上；SEQIDNO:4(编码所述嵌合抗原受体2的核苷酸序列)通过酶切位点NheI和EcoRI连接到该载体上。本专利技术的方案中，所述嵌合抗原受体1即AntiMUC1synNotch分子在与MUC1抗原结合后可释放转录因子Gal4-VP64，该转录因子可结合到AntiCD19CAR分子的启动子前的转录因子结合位点(即转录因子Gal4-VP64的结合序列)上，促进所述嵌合抗原受体2即AntiCD19CAR基因表达，从而可靶向并杀伤CD19高表达的肿瘤细胞。本专利技术方案具有以下优点：1)本专利技术提供的基因修饰的T淋巴细胞，能够特异性识别和高效杀伤MUC1和CD19阳性的肿瘤。2)嵌合抗原受体1在与MUC1抗原结合后发挥转录开关的作用，能控制嵌合抗原受体2表达，从而实现可控地并且特异性地识别和杀伤MUC1和CD19阳性表达的肿瘤。附图说明图1A显示了改造前慢病毒质粒载体pGreenpuro本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.表达于T淋巴细胞表面的嵌合抗原受体组合，其特征在于，包括嵌合抗原受体1即Anti MUC1 synNotch具有如下顺序连接的三个部分：特异性识别MUC1蛋白的SCFV、Notch core和转录因子Gal4‑VP64；以及嵌合抗原受体2即Anti CD19 CAR具有如下的顺序连接的胞外结合区，铰链区和胞内信号区：特异性识别CD19蛋白的SCFV，IgD，CD28–4‑1BB–CD3ζ。
【技术特征摘要】
1.表达于T淋巴细胞表面的嵌合抗原受体组合，其特征在于，包括嵌合抗原受体1即AntiMUC1synNotch具有如下顺序连接的三个部分：特异性识别MUC1蛋白的SCFV、Notchcore和转录因子Gal4-VP64；以及嵌合抗原受体2即AntiCD19CAR具有如下的顺序连接的胞外结合区，铰链区和胞内信号区：特异性识别CD19蛋白的SCFV，IgD，CD28–4-1BB–CD3ζ。2.根据权利要求1所述的表达于T淋巴细胞表面的嵌合抗原受体组合，所述嵌合抗原受体1具有SEQIDNO:1所述的氨基酸序列。3.根据权利要求1所述的表达于T淋巴细胞表面的嵌合抗原受体组合，所述嵌合抗原受体2具有SEQIDNO:2所述的氨基酸序列。4.编码权利要求1-3任一项所述嵌合抗原受体组合的核酸。5.如权利要求4所述的核酸，其特征在于，编码所述嵌合抗原受体1核苷酸序列具有SEQIDNO:3所述的核苷酸序列，编码所述嵌合抗原受体2核苷酸序列具有SEQIDNO:4所述的核苷酸序列。...
【专利技术属性】
技术研发人员：刘未斌，刘曲波，李琼书，胡源，
申请(专利权)人：深圳市芥至和生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：广东,44
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