一种二聚体化融合蛋白及其制备方法和应用技术

本发明专利技术属于基因工程制药领域，具体涉及一种二聚体化融合蛋白及其制备方法和应用。所述二聚体化融合蛋白包含1个促血小板生成素模拟肽(TMP)二联体蛋白结构域，1个人血清白蛋白第三结构域(3DHSA)。其中，TMP二联体之间、TMP二联体与3DHSA之间由连接肽及二聚体化结构域相连。本发明专利技术所述的TMP二联体与人血清白蛋白第三结构域的二聚体化融合蛋白能够与促血小板生成素受体c‑mpl作用，具有刺激TPO依赖性细胞系增殖的活性，能在哺乳动物细胞中表达。可在制备促血小板生成素的药物中应用，是促血小板生成素的有效候选药物。本发明专利技术还提供所述TMP二联体与人血清白蛋白第三结构域的二聚体化融合蛋白的制备方法。

A Dimerized Fusion Protein and Its Preparation and Application

The invention belongs to the field of genetic engineering pharmacy, in particular to a dimerized fusion protein, a preparation method and application thereof. The dimerized fusion protein comprises a thrombopoietin mimic peptide (TMP) dimer protein domain and a human serum albumin third domain (3DHSA). Among them, TMP dimers, TMP dimers and 3D HSA are linked by ligand peptides and dimer domains. The dimerized fusion protein of TMP dimer and human serum albumin third domain can interact with thrombopoietin receptor C mpl, has the activity of stimulating TPO-dependent cell line proliferation, and can be expressed in mammalian cells. It can be used in the preparation of thrombopoietin and is an effective candidate for thrombopoietin. The invention also provides a preparation method of the dimerized fusion protein of the TMP dimer and the third domain of human serum albumin.

【技术实现步骤摘要】
一种二聚体化融合蛋白及其制备方法和应用
本专利技术属于基因工程制药领域，具体涉及一种促血小板生成素模拟肽(Thrombopoietinmimeticpeptide,TMP)二联体-人血清白蛋白第三结构域(Thethirddomainofhumanserumalbumin，3DHSA)的二聚体化融合蛋白及其制备方法和应用。
技术介绍
随着DNA重组技术的成熟和生物制药技术的发展，重组蛋白药物因为其氨基酸序列和碱基序列清楚，安全性高等优点成为目前新药研究的热门领域，有着广阔的发展前景。然而有很多小分子量多肽蛋白药物由于分子量较小，分子结构不稳定的原因，在体内容易被降解或被肾脏清除，导致该类药物在血浆中存留时间短(金光泽等，2010)。药物在短时间内的多次注射，不但会造成血药浓度的不稳定，而且会给患者增加身体上痛苦和经济上的压力(边蕾,石屹峰，2009)。因此，优化蛋白质药物的有效性和长效性等参数已成为生物制药的重要研究方向(赵洪亮等，2005)。大量研究表明，三个相似的结构域一起组成了HSA。根据独立研究HSA各结构域的结构与功能，得出HSA各结构域上都含有一些与配合基结合的位点，但是所结合的配体各不相同(KatoY,etal.)。研究表明，安定类药物结合位点在HSA-D3上，一些阻凝剂结合位点在大部分在HSA-D2，极少数在HSA-D1上。研究还证明，主要的配体结合位点主要在HSA的HSA-D2和HSA-D3上(ThomasKjeldsenetal,1998)。VaniaEKenanova等研究证明IIIA和IIIB子结构在白蛋白稳定性功能维持中具有重要作用(VaniaEKenanovaetal,2010),Chaudhury等研究证明HSA-D3上拥有FcRn结合的所有位点。(Chaudhuryetal,2006)。近来大量研究发现，3DHSA是药物受体结合的主要部位，与蛋白融合之后能增加目的蛋白的分子量，在受体介导的胞吞保护作用下能耐受酸性环境和蛋白酶的降解，与HSA全长蛋白具有相似的功能，并且能降低融合入蛋白纯化的难度和降低临床用药时出现免疫反应的风险。赵述强等人的研究初步证明，利用毕赤酵母表达系统表达融合蛋白3DHSA与HSA，两者相比，融合蛋白3DHSA未出现之前的降解现象，纯化过程中也未出现聚合现象，且能更大强度避免肾脏的虑过作用，增强蛋白的稳定性。所表达外源蛋白3DHSA-Nartograstim能够刺激小鼠细胞NFS-60增值,并且成浓度依赖型(赵述强等，2013)。因此，HSA-D3的深入研究为进一步研究长效融合蛋白药物提供了重要依据和线索。1997年，AF12505作为高活性TPO模拟肽被Cwirla等筛选出来。并证明AF12505为14个氨基酸的短肽，具有刺激rhTPO依赖性细胞株增值的功能(邵波，2006)。但是活性很低，仅为rhTPO的1/4000。对AF12505进行二聚体修饰后，活性显著提高。接着，对AF12505分别进行了化学修饰和生物修饰，发现IgG1Fc-TPO融合蛋白具有促进TPO依赖型细胞株的增值功。2008，安进公司将AF12505与抗体的Fc片段融合，开发出产品Nplate，用于治疗原发性血小板减少症。该产品具有TPO活性，且同TPO不同源，避免了中和性抗体的产生，但是由于Fc片段为非惰性蛋白，它在体内可介导多种免疫反应。接着，我国科研工作者为克服Nplate的缺点，把AF12505与HSA相连，构建出了融合蛋白，但是活性实验结果显示，此融合蛋白并不具有促进血小板生成的生物活性。关于TMP-HSA长效药物的研究，分子结构上，TMP单体是由14个氨基酸构成的短肽，氨基酸序列为IEGPTLRQWLAARA(Ile-Glu-Gly-Pro-Thr-Leu-Arg-Gln-Trp-LeU-Ala-Ala-Arg-Ala)。此氨基酸序列与TPO没有序列同源性，因此不会引起自身交叉感染(邵波，2006)。理论上，当TMP以二聚体的形式存在时，能够与两个距离较近的促血小板生成素受体c-mpl分别结合，传导酪氨酸磷酸化信号进入细胞核，激活核糖体上蛋白的合成，促进巨噬细胞生长因子的成熟，促进血小板生成(Drachman,J.Getal.,1999)。计算机模拟显示蛋白连接肽linker(L)一般有四种存在形式，氨基酸序列分别为SG，GGGSG，GGPSG和GGGGSGGGSG。本实验室前期研究通过利用不同的L作为TMP的连接肽来构建TMP二联体。接着，通过大量文献调研，在HSA和TMP核酸序列之间设计了一段很短的连接片段(此片段选自免疫球蛋白绞链区，其中含有半胱氨酸，易形成二硫键)，使HSA和TMP片段在空间上相对独立。并成功构建了重组载体，然后与酵母染色体整合,成功诱导表达出目的蛋白质，并利用20升发酵罐发酵生产出了目的蛋白样品(中国专利201310084035，2013)，建立了TMP融合蛋白体外活性检测系统(中国专利201310084212,2013)。研究者发现HSA融合蛋白在表达生产过程会产生一些共性问题，比如，HSA融合蛋白在表达、保存过程中会发生聚合或降解，体外生物活性会不同程度降低，表达产物不均一、表达水平低等(CordesAAetal.,2012,2012；刘文慧，2015)，这种现象既增加了蛋白纯化的难度，也使临床用药过程中出现免疫反应的风险增大。近年来研究发现，位于第381-585位氨基酸残基的HSA第三结构域(HSAD3,23kDa)是HSA与FcRn受体结合的关键部位，在受体介导的胞吞保护作用下耐受酸性环境和蛋白酶的降解，保证了HSA体内较长的半衰期，承担了HSA蛋白的主要功能(ChaudhuryCetal.,2006,2003)。SadaharuMatsushita等人(Sadaharuetal.,2004)对HSA的3个结构域的生物学功能进行了研究。结果显示，HSADⅢ保留了HSA45％的类酯酶活性，在pH7.4的磷酸盐中，表现了微弱的类烯醇酶活性。ShuqiangZhao等人(ShuQiangZhaoetal.,2013；赵述强等，2013)利用HSAD3构建了3DHSA-Nartograstim融合蛋白表达载体，以毕赤酵母GS115为表达宿主，成功分泌并表达出了目的蛋白，表达产量为86mg/L。而且，在工程酵母发酵过程中没有发现HSA融合蛋白常发生的降解现象，在融合蛋白纯化过程中，也未发生聚合和降解，体外活性实验表明3DHSA-Nartograstim具有与G-CSF(HSA-Nartograstim)类似的生物学功能，即剂量依赖性刺激NFS-60小鼠的细胞增殖的作用。VaniaE.Kenanova等人(VaniaEetal.,2010)通过融合蛋白技术构建了双特异抗体-HSADⅢ(T84.66Db-HSAD3)融合蛋白，获得纯度约98％，结构稳定的目的蛋白。体内生物活性实验表明Db-HSADⅢ在体内的直接放射性计数(％ID/g)是Db的50倍，血液平均滞留时间(MRT)是Db的20倍，说明HSADШ具有良好的增加小分子蛋白药物稳定性，延长半衰期的效果。此前，PaulJ.Yazaki(Pauletal.,2008)等人构建的T84本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种二聚体化融合蛋白，其特征在于，所述的二聚体化融合蛋白包括促血小板生成素模拟肽(TMP)二联体、连接肽及人血清白蛋白第三结构域(3DHSA)，所述的二聚体化融合蛋白还含有二聚体化结构域。

【技术特征摘要】
1.一种二聚体化融合蛋白，其特征在于，所述的二聚体化融合蛋白包括促血小板生成素模拟肽(TMP)二联体、连接肽及人血清白蛋白第三结构域(3DHSA)，所述的二聚体化融合蛋白还含有二聚体化结构域。2.根据权利要求1所述的一种二聚体化融合蛋白，其特征在于所述二聚体化结构域是通过二硫键的共价作用使融合蛋白二聚体化。3.根据权利要求1所述的一种二聚体化融合蛋白，其特征在于，所述二聚体化结构域为肽段H和选自fip结构域的肽段fip。所述肽段H的基因序列如SeqIDNo:7所示，氨基酸序列如SeqIDNo:8所示。所述fip结构域的基因序列如SeqIDNo:9所示，氨基酸序列如SeqIDNo:10所示。4.根据权利要求1-3所述的一种二聚体化融合蛋白，其特征在于，所述TMP包括2个TMP和1个连接肽，结构式表示为：TMP-L1-TMP，氨基酸序列如SEQIDNO：2所示，基因序列如SEQIDNO：1所示，其中L1表示连接肽，L1的DNA序列为GGTGGCCCCTCCGGA，氨基酸序列为GGPSG，TMP二联体之间为首尾相连。5.根据权利要求1所述的一种二聚体化融合蛋白，其特征在于，所述3DHSA具有SEQIDNO：4所示的氨基酸序列，编码所述3DHSA的氨基酸序列的DNA序列如SEQIDNO：3所示；或在所述氨基酸序列中取代、缺失或插入氨基酸残基所得到的具有所述3DHSA的活性的氨基酸序列，及编码所述的氨基酸序列的DNA序列。6.根据权利要求1-3所述的一种二聚体化融合蛋白，其特征在于，所述TMP二联体位于融合蛋白的N-末端，3DHSA位于融合蛋白的C-末端，结构式表示为：TMP-L1-TMP-L2-H-fip-3DHSA。7.根据权利要求6所述的一种二聚体化融合蛋白，其特征在于，所述融合蛋白的氨基酸序列如SEQIDNO：6所示，编码所述融合蛋白的氨基酸序列的DNA序列如SEQIDNO：5所示。8.根据权利要求1-7中任意一项所述的一种促血小板生成素模拟肽二联体-人血...

【专利技术属性】
技术研发人员：李红玉，张丽芸，王梅竹，茹毅，支德娟，李洋，陈晓雨，赵晶，戴治娟，
申请(专利权)人：兰州大学，
类型：发明
国别省市：甘肃,62