一种鸭坦布苏病毒的ELISA抗体检测试剂盒及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种鸭坦布苏病毒的ELISA抗体检测试剂盒及其应用。所述试剂盒中包括鸭坦布病毒E蛋白重组融合特异性抗原表位蛋白包被的ELISA板，所述的重组融合特异性抗原表位蛋白是由SEQ ID NO.1所示的鸭坦布苏病毒E蛋白的特异性抗原表位蛋白与SEQ ID NO.2所示的鸭坦布苏病毒E蛋白的特异性抗原表位蛋白通过柔性肽连接后得到。本发明专利技术利用鸭坦布苏病毒E蛋白特异性的抗原表位串联成融合抗原，特异性强，仅对DTMUV阳性血清具有敏感性，对鸭其他种类疾病阳性血清如(DHV‑I，DEV，MDPV)以及DENV、JEV、WNV、ZIKV等阳性血清不具有敏感性。此外，使用本发明专利技术的试剂盒检测DTMUV简单易行且安全性高，包被抗原为抗原表位串联肽段，相对于E蛋白更易于获得，且相对于全病毒包被方法安全性更高。

An ELISA Antibody Kit for Duck Tambusu Virus and Its Application

The invention discloses an ELISA antibody detection kit for duck Tambusu virus and its application. The kit includes an ELISA plate coated with recombinant fusion specific antigen epitope protein of duck tambusu virus E protein. The recombinant fusion specific antigen epitope protein is obtained by connecting the specific antigen epitope protein of duck tambusu virus E protein shown in SEQ ID NO.1 with the specific antigen epitope protein of duck tambusu virus E protein shown in SEQ ID NO.2 through a flexible peptide. The invention utilizes the specific antigen epitope of duck Tambusu virus E protein to form fusion antigen, which has strong specificity and is sensitive only to DTMUV positive serum, but not to other kinds of disease positive serum such as DHV_I, DEV, MDPV and DENV, JEV, WNV, ZIKV positive serum. In addition, the detection of DTMUV using the kit of the present invention is simple, feasible and safe. The coated antigen is a tandem peptide segment of the antigen epitope, which is easier to obtain than E protein, and is safer than the whole virus coating method.

【技术实现步骤摘要】
一种鸭坦布苏病毒的ELISA抗体检测试剂盒及其应用
本专利技术涉及一种鸭坦布苏病的ELISA抗体检测试剂盒及其应用，本专利技术属于免疫学

技术介绍
鸭坦布苏病毒病是由鸭坦布苏病毒(Ducktembusuvirus,DTMUV)引起的一种急性传染病，该病于2010年在我国南方地区首次爆发，随后疾病迅速传播危害到全国各地的鸭养殖场，造成了巨大经济损失。目前针对鸭坦布苏病毒病的诊断方法主要存在两种，第一种是分子生物学诊断方法，它的基本原理是根据病毒核酸序列设计出特异性的扩增引物，以反转录得到病毒的cDNA为模板利用PCR技术扩增病毒核酸的目的片段，从而检测病毒的方法，第二种是血清学诊断方法，主要包活间接免疫荧光试验(Immunonuorescenceassay,IFA)、酶联免疫吸附试验(Enzyme-linkedimmunosorbentassay,ELISA)，原理是利用抗体与病毒上相应的抗原部分结合后，再利用特定标记的二抗与已结合的抗体发生作用，通过荧光显微镜观察或读取OD值而推知抗原的存在。但是以上两种检测方法均存在不足之处：(1)分子生物学诊断方法对于实验的仪器要求较高，适合实验室进行病原的检测而不适用大规模的临床检测；(2)血清学诊断方法中，间接免疫荧光实验(IFA)对实验材料以及设施同样要求较高，因此一般也不用于临床检测，而ELISA诊断方法一般是常用的临床诊断方法，该方法简单、高效，可同时检测大规模的样品，但目前实验室建立的ELISA诊断方法以及商品化的试剂盒，大都选用纯化灭活的鸭坦布苏病毒或鸭坦布苏病毒E蛋白作为抗原进行包被，这些方法灵敏度高、敏感性较好，但存在最大一个问题就是交叉反应性，由于鸭坦布苏病毒属于黄病毒科黄病毒属，而黄病毒属各个病毒E蛋白间的同源性较高，因此无论是利用全病毒或是E蛋白建立的ELISA诊断方法都会与黄病毒属其他病毒产生交叉反应现象。抗原表位(Epitope)又称抗原决定簇(Antigenicdeterminant,AD)是引起免疫应答的物质基础，能够与血清中的抗体发生特异性的结合，因此利用病毒蛋白特异性的抗原表位建立的血清学ELISA诊断方法，有其自身的优点和特殊性，即减少了无关干扰序列的影响，又增强其特异性。鸭坦布病毒E蛋白Epitope-ELISA诊断方法是一种特异性的检测方法，仅对DTMUV阳性血清具有敏感性，而对鸭其他种类疾病阳性血清(鸭肝炎、鸭瘟、番鸭细小)以及DENV、JEV、WNV、ZIKV等阳性血清不具有敏感性。
技术实现思路
本专利技术解决的技术问题是提供检测鸭坦布苏病毒抗体的ELISA诊断试剂盒。本专利技术的目的在于根据现有的鸭坦布苏病毒病ELISA抗体检测方法中存在交叉反应性、特异性不强和检测结果缺乏准确性等问题，提供一种采用鸭坦布病毒E蛋白特异性抗原表位作为检测抗原的鸭坦布苏病毒ELISA抗体诊断试剂盒，该试剂盒具有种特异性强和免疫原性强的特点。为了达到上述目的，本专利技术采用了以下技术手段：首先，利用本专利技术人前期制备的两株抗鸭坦布苏病毒E蛋白的单克隆抗体1A5与4E9进行抗原表位的鉴定。针对单克隆抗体1A5和4E9，我们利用亲和层析柱对其进行纯化，并利用噬菌体展示技术鉴定出其抗原表位YAEYI和SGKG。Dot-Blotting结果显示抗原表位YAEYI与SGKG为鸭坦布苏病毒E蛋白特异性抗原表位，在其他黄病毒血清间不存在交叉反应性，以及与鸭其他病毒病阳性血清也不存在交叉反应性，特异性强，因此两个特异性抗原表位可用于特异性ELISA抗体诊断方法的建立。接下来人工合成抗原表位的核苷酸序列，并且两个表位间加入一个Gly-Ser(甘氨酸-丝氨酸)柔性肽进行连接，将合成的核苷酸序列连接到pGEX-6P-1质粒载体上，用大肠杆菌DH5α筛选高拷贝重组子，将重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)中，从而构建重组大肠杆菌BL21(DE3)工程菌，将重组大肠杆菌BL21(DE3)工程菌在IPTG诱导下进行蛋白表达，经过过柱纯化或切胶进行纯化(由于所筛选的抗原表位为线性抗原表位，不存构象关系，因此切胶纯化不影响其抗原性)，得到融合表达的特异性抗原表位蛋白。最后，将纯化的重组融合抗原表位蛋白包被酶标板，建立间接ELISA检测方法。重组抗原最适包被浓度和血清最适稀释度的确定：将重组抗原用碳酸盐缓冲液稀释不同梯度后每孔100μL包被于96孔板，4℃过夜，鸭坦布苏病毒标准阴、阳性血清进行倍比稀释组成方阵，结果判定P/N值(标准阳性血清OD450nm/标准阴性血清OD450nm)最大时为最适抗原抗体工作浓度。最佳封闭液选择：分别以5％w/w聚乙烯醇、5％w/w脱脂乳、1％w/wBSA、1％w/w明胶、2％w/w卵清蛋白溶液作为封闭液对ELISA板进行封闭，对血清样品进行检测，P/N值最大时则为最佳封闭液。血清与二抗最适工作时间的确定：以最适稀释度的重组抗原包被96孔酶标板，加入最适稀释度的标准阳性血清，将作用时间分别设定为37℃30min、45min、60min、90min，P/N值最大时为血清与抗体最适作用时间。间接ELISA阴阳性临界值的确定：据试验确立的ELISA最佳反应条件，对25份鸭DTMUV阴性血清样品进行检测，根据结果计算阴性样品的OD450nm的平均值和标准差，确定阴阳性标准的临界值，阴阳性临界值＝阴性样品平均值±3×标准差。在上述研究的基础上，首先，本专利技术提出了一种鸭坦布病毒E蛋白重组融合特异性抗原表位蛋白，所述的重组融合特异性抗原表位蛋白是由SEQIDNO.1所示的鸭坦布苏病毒E蛋白的特异性抗原表位蛋白与SEQIDNO.2所示的鸭坦布苏病毒E蛋白的特异性抗原表位蛋白通过柔性肽连接后得到。其中，优选的SEQIDNO.1所示的鸭坦布苏病毒E蛋白的特异性抗原表位蛋白与SEQIDNO.2所示的鸭坦布苏病毒E蛋白的特异性抗原表位蛋白通过Gly-Ser柔性肽进行连接，所述的重组融合特异性抗原表位蛋白的氨基酸序列如SEQIDNO.3所示。进一步的，本专利技术还提出了所述的重组融合特异性抗原表位蛋白在制备鸭坦布病毒抗体检测试剂中的用途。更进一步的，本专利技术还提出了一种鸭坦布苏病毒的ELISA检测试剂盒，所述试剂盒中包括鸭坦布病毒E蛋白重组融合特异性抗原表位蛋白包被的ELISA板，所述的重组融合抗原表位蛋白是由SEQIDNO.1所示的鸭坦布苏病毒E蛋白的特异性抗原表位蛋白与SEQIDNO.2所示的鸭坦布苏病毒E蛋白的特异性抗原表位蛋白通过柔性肽连接后得到。在所述的ELISA抗体检测试剂盒中，优选的，鸭坦布病毒E蛋白重组融合特异性抗原表位蛋白的包被浓度为6.4μg/mL，封闭液为1％w/wBSA溶液。在所述的ELISA抗体检测试剂盒中，还包括洗涤缓冲液、样品稀释液、酶标二抗、底物显色液和终止液。在所述的ELISA抗体检测试剂盒中，所述洗涤缓冲液是含0.5％Tween-20的10mMPBST，pH7.4；所述样品稀释液为含有0.05％Tween-20的10mmol/LPBST，pH值7.4；所述酶标二抗是辣根过氧化物酶(HRP)标记的羊抗鸭IgG；所述底物显色液是0.01％w/w的3,3',5,5'-四甲基联苯胺溶液；所述终止液是2M硫酸溶液。使用所述的ELISA抗体检测试本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种鸭坦布病毒(Duck tembusu virus,DTMUV)E蛋白重组融合特异性抗原表位蛋白，其特征在于，所述的重组融合特异性抗原表位蛋白是由SEQ ID NO.1所示的鸭坦布苏病毒E蛋白的特异性抗原表位蛋白与SEQ ID NO.2所示的鸭坦布苏病毒E蛋白的特异性抗原表位蛋白通过柔性肽连接后得到。

【技术特征摘要】
1.一种鸭坦布病毒(Ducktembusuvirus,DTMUV)E蛋白重组融合特异性抗原表位蛋白，其特征在于，所述的重组融合特异性抗原表位蛋白是由SEQIDNO.1所示的鸭坦布苏病毒E蛋白的特异性抗原表位蛋白与SEQIDNO.2所示的鸭坦布苏病毒E蛋白的特异性抗原表位蛋白通过柔性肽连接后得到。2.根据权利要求1所述的重组融合特异性抗原表位蛋白，其特征在于，SEQIDNO.1所示的鸭坦布苏病毒E蛋白的特异性抗原表位蛋白与SEQIDNO.2所示的鸭坦布苏病毒E蛋白的特异性抗原表位蛋白通过Gly-Ser柔性肽进行连接，所述的融合特异性抗原表位蛋白的氨基酸序列如SEQIDNO.3所示。3.权利要求1或2所述的重组融合特异性抗原表位蛋白在制备鸭坦布病毒抗体检测试剂中的用途。4.一种鸭坦布苏病毒的ELISA抗体检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中包括鸭坦布病毒E蛋白重组融合特异性抗原表位蛋白包被的ELISA板，所述的重组融合特异性抗原表位蛋白是由SEQIDNO.1所示的鸭坦布苏病毒E蛋白的特异性抗原表位蛋白与SEQIDNO.2所示的鸭坦布苏病毒E蛋白的特异性抗原表位蛋白通过柔性肽连接后得到。5.根据权利要求4所述的ELISA抗体检测试剂盒，其特征在于，SEQIDNO.1所示的鸭坦布苏病毒E蛋白的特异性抗原表位蛋白与SEQIDNO.2所示的鸭坦布苏病毒E蛋白的特异性抗原表位蛋白通过Gly-Ser柔性肽进行连接，所述的重组融合特异性抗原表位蛋白的氨基酸序列如SEQIDNO.3所示。6.根据权利要求4所述的ELISA抗体检测试剂盒，其特征在于，鸭坦布病毒E蛋白重组融合特异性抗原表位蛋白的包被浓度为6.4μg/mL，封闭液为1％w/wBSA溶液。7.根据权利要求4-6任一项所述的ELISA抗体检测试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒中还包括洗涤缓...

【专利技术属性】
技术研发人员：张云，李晨曦，刘明，李赞，
申请(专利权)人：中国农业科学院哈尔滨兽医研究所中国动物卫生与流行病学中心哈尔滨分中心，哈尔滨维科生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：黑龙江,23