【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于病毒检测，具体涉及一种bvdv特异crrna及其相关试剂盒与检测方法。
技术介绍
1、牛病毒性腹泻（bvd）是由牛病毒性腹泻病毒（bvdv）引起的一种在世界范围内广泛流行的传染病。牛感染bvdv后轻则出现腹泻、发热症状，重则直接死亡，导致奶牛产奶量下降、育肥牛产肉质量降低及种用牛繁殖能力下降；孕畜感染则会发生流产，产出死胎或畸形胎。此外，如母畜在妊娠期40-120天感染，bvdv可通过胎盘传播至胎儿，若胎儿幸存则会成为持续感染（pi）牛，其分泌物和排泄物中存在大量病毒，是bvdv的主要传染源之一。
2、bvdv是单股正链rna病毒，属于黄病毒科瘟病毒属成员，病毒粒子有囊膜，具有耐高温、存活期长等特点。bvdv基因组全长为12.3 kb左右，由5'非编码区（5'utr），3'非编码区（3'utr）和开放阅读框（orf）组成，其中，最保守序列为5'utr。在所有的基因组区域中，5'utr、npro和e2基因被广泛地用于序列比对、基因分型和系统发育分析。据此，bvdv被分为三种主要基因型，即bvdv-1、bvdv-2和bvdv-3。又根据5'utr，bvdv-1被分为21个基因亚型（bvdv-1a至bvdv-1u），bvdv-2被分为4个亚型（bvdv-2a至bvdv-2d）。
3、因此，建立可用于现场的bvdv快速精确检测方法尤为重要，尤其是对精准剔除牛群中pi牛更为重要。
4、目前，bvdv的检测方法主要分为血清学检测方法、病毒抗原检测、经典病毒分离培养和病毒核酸检测。其中，普通p
5、基于crispr技术的核酸检测方法因其特异性好、敏感性高、简单、易于现场实施而得到广泛应用。目前现有技术已建立了基于cas13a的基因3型bvdv和bvdv nadl毒株的检测方法，例如，申请号为cn202310728497.8，专利技术名称为一种用于检测牛病毒性腹泻病毒3型的试剂盒与检测方法及申请号为cn202010905632.8，专利技术名称为基于crispr-cas13a的牛病毒性腹泻病毒的检测方法的专利，然而上述方法检测只能针对特定毒株进行检测，具有检测局限性，且敏感性偏低。与cas13a具有切割单链rna的活性不同，cas12a具有切割双链dna片段活性，当cas12-crrna-靶标dna序列三元复合物形成时，cas12蛋白表现出反式切割活性。通过将cas12蛋白与预扩增步骤相结合，可开发更灵敏的核酸检测生物传感器平台。
6、因此，开发一种基于crispr-cas12a的快速、灵敏度高、特异强，不依赖实验室精密仪器，且可在1小时内得到可视化检测结果的bvdv现地检测方法具有重要应用前景及实践意义。
技术实现思路
1、本专利技术公开了一种基于crispr-cas12a的bvdv特异crrna及其相关试剂盒与检测方法，解决了现有的bvdv检测方法耗时长、假阳性率高、需要昂贵仪器或专业技术人员、无法实现现场实时检测的技术问题。
2、本专利技术的技术方案如下：
3、一种基于crispr-cas12a的bvdv特异crrna，所述bvdv特异crrna为seq id no.1~seq id no.6任一所示crrna或seq id no.1~seq id no.6所示任意两种以上crrna混合。
4、进一步的，所述bvdv特异crrna为seq id no.1、seq id no.3、seq id no.4和seqid no.5所示的crrna等比例混合。
5、一种基于crispr-cas12a的检测不同亚型bvdv的试剂，所述基于crispr-cas12a的检测不同亚型bvdv的试剂包括上述bvdv特异crrna。
6、上述bvdv特异crrna在制备检测bvdv的试剂盒中的应用。
7、上述试剂在制备检测bvdv的试剂盒中的应用。
8、一种基于crispr-cas12a的检测不同亚型bvdv的试剂盒，所述试剂盒包括上述bvdv特异crrna，bvdv 5'utr基因等温扩增试剂、crispr-cas12a蛋白酶，ssdna报告系统，核酸酶抑制剂和nebuffer 3.1。
9、进一步的，所述bvdv 5'utr基因等温扩增试剂包括等温扩增引物对，所述等温扩增引物对的上游引物为如seq id no.13所示的核苷酸序列，下游引物为如seq id no.17所示的核苷酸序列。
10、进一步的，所述ssdna报告系统为5'端fam标记、3'端bhq1标记的单链核苷酸序列。
11、所述试剂盒在非疾病诊断目的的bvdv可视化检测中的应用。
12、一种可视化检测bvdv的方法，采用上述试剂盒进行检测，包括如下步骤：
13、s1、取待测样品，利用核酸释放剂释放样品中的核酸；
14、s2、将s本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种基于CRISPR-Cas12a的BVDV特异crRNA，其特征在于，所述BVDV特异crRNA为SEQID NO.1~SEQ ID NO.6任一所示crRNA或SEQ ID NO.1~SEQ ID NO.6所示任意两种以上crRNA混合。
2.根据权利要求1所述的BVDV特异crRNA，其特征在于，所述BVDV特异crRNA为SEQ IDNO.1、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.5所示的crRNA等比例混合。
3.一种基于CRISPR-Cas12a的检测不同亚型BVDV的试剂，其特征在于，所述基于CRISPR-Cas12a的检测不同亚型BVDV的试剂包括权利要求1或2任一所述BVDV特异crRNA。
4.权利要求1或2所述BVDV特异crRNA在制备检测BVDV的试剂盒中的应用。
5.权利要求3所述试剂在制备检测BVDV的试剂盒中的应用。
6.一种基于CRISPR-Cas12a的检测不同亚型BVDV的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括权利要求1或2任一所述BVDV特异crRNA
7.根据权利要求6所述的试剂盒，其特征在于，所述BVDV 5'UTR基因等温扩增试剂包括等温扩增引物对，所述等温扩增引物对的上游引物为如SEQ ID NO.13所示的核苷酸序列，下游引物为如SEQ ID NO.17所示的核苷酸序列。
8.根据权利要求6所述的试剂盒，其特征在于，所述ssDNA报告系统为5'端FAM标记、3'端BHQ1标记的单链核苷酸序列。
9.权利要求6-8任一所述试剂盒在非疾病诊断目的的BVDV可视化检测中的应用。
10.一种可视化检测BVDV的方法，其特征在于，采用权利要求6-8任一所述试剂盒进行检测，包括如下步骤：
...【技术特征摘要】
1.一种基于crispr-cas12a的bvdv特异crrna，其特征在于，所述bvdv特异crrna为seqid no.1~seq id no.6任一所示crrna或seq id no.1~seq id no.6所示任意两种以上crrna混合。
2.根据权利要求1所述的bvdv特异crrna，其特征在于，所述bvdv特异crrna为seq idno.1、seq id no.3、seq id no.4和seq id no.5所示的crrna等比例混合。
3.一种基于crispr-cas12a的检测不同亚型bvdv的试剂，其特征在于，所述基于crispr-cas12a的检测不同亚型bvdv的试剂包括权利要求1或2任一所述bvdv特异crrna。
4.权利要求1或2所述bvdv特异crrna在制备检测bvdv的试剂盒中的应用。
5.权利要求3所述试剂在制备检测bvdv的试剂盒中的应用。
6.一...
【专利技术属性】
技术研发人员：尹鑫，王鑫杰，常继涛，王芳，姜志刚，
申请(专利权)人：中国农业科学院哈尔滨兽医研究所中国动物卫生与流行病学中心哈尔滨分中心，
类型：发明
国别省市：
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