本发明专利技术提供一种抗CD19抗体和MUC1抗原肽的偶联物及其应用，所述偶联物包括抗CD19抗体重链，以及偶联有MUC1抗原肽的抗CD19抗体轻链即抗CD19抗体轻链‑MUC1；所述抗CD19抗体重链的氨基酸序列为SEQ ID NO:1所示的序列；所述抗CD19抗体轻链‑MUC1的氨基酸序列为SEQ ID NO:2所示的序列。所述偶联物与靶向MUC1的T淋巴细胞联合给药，可以获得同时靶向MUC1和CD19的治疗效果，对MUC1和CD19双抗原同时表达的肿瘤细胞具有较强的杀伤作用。
Coupling of Anti-CD19 Antibody and MUC1 Antigen Peptide and Its Application
The invention provides a conjugate of anti-CD19 antibody and MUC1 antigen peptide and its application. The conjugate includes anti-CD19 antibody heavy chain and anti-CD19 antibody light chain coupled with MUC1 antigen peptide, i.e. anti-CD19 antibody light chain MUC1; the amino acid sequence of anti-CD19 antibody heavy chain is SEQ ID NO:1; the amino acid sequence of anti-CD19 antibody light chain MUC1 is SEQ ID NO:2. The sequence shown. The conjugate can be combined with T lymphocyte targeting MUC1 to obtain the therapeutic effect of simultaneously targeting MUC1 and CD19, and has a strong killing effect on tumor cells expressing both MUC1 and CD19 antigens.
【技术实现步骤摘要】
抗CD19抗体和MUC1抗原肽的偶联物及其应用
本专利技术涉及基因修饰细胞及肿瘤治疗
，尤其涉及一种抗CD19抗体和MUC1抗原肽的偶联物及其应用。
技术介绍
CAR-T疗法，全称为ChimericAntigenReceptorT-CellImmunotherapy，嵌合抗原受体T细胞免疫疗法。其主要原理是，从癌症病人身上分离免疫T细胞，利用基因工程技术为T细胞引入一个能够识别肿瘤细胞并同时激活T细胞的嵌合抗体，也就是制备CAR-T细胞，再将扩增好的CAR-T细胞回输到病人体内，通过免疫疗法对抗癌细胞。CAR-T的结构按照所处位置分为胞外区、跨膜区、胞内区三部分。胞外区又可以分为胞外铰链区(促进抗原受体与肿瘤抗原的结合)和肿瘤相关抗原结合区(scFv，用于识别并结合肿瘤特异性抗原)，选择不同的肿瘤标志物作为抗原以杀伤不同的肿瘤细胞；跨膜区起到固定CAR作用；胞内区分为T细胞活化区(提供T细胞活化的第一信号，激活T细胞的增殖信号通路)和共刺激区(提供T细胞活化的第二信号，维持T细胞的生存时间)，不同信号分子的选择对构建成的CAR-T细胞增殖分化、活性、因子分泌起到关键性作用。与传统的肿瘤治疗策略相比，CAR-T细胞对肿瘤细胞的杀伤精准度高，而且不依赖于MHC(主要组织相容性复合体)的限制性。近年来，在B细胞淋巴瘤等血液恶性肿瘤的治疗中取得了积极的进展。除了血液系统肿瘤中的应用，研究者也将此项技术积极应用于实体肿瘤的治疗，如神经母细胞瘤、胶质瘤、胰腺癌等。主要的成功案例集中在特异性靶向CD19分子的CAR-T。CD19是正常和恶性B淋巴细胞特异性表面蛋白，在B细胞的发育、增殖和分化以及恶性转化中发挥重要作用。因CD19在B淋巴细胞表达的特异性和恶性肿瘤表达的广泛性，使其成为一个颇具潜力的B淋巴细胞恶性肿瘤免疫治疗的分子靶点从而受到极大的关注。截至目前，全球共有2种CAR-T产品获批上市，靶点均为CD19，分别是来自诺华的Kymriah(tisagenlecleucel)(CTL019)和Kite制药的Yescarta(KTE-C19)，它们分别用于治疗儿童和年轻成人(2～25岁)的急性淋巴细胞白血病和特定类型大B细胞淋巴瘤。Mucin1是膜结合型粘蛋白家族成员，简称MUC1。在正常情况下，MUC1呈低水平表达在乳腺，胰腺，胃肠道，呼吸道及泌尿生殖道的上皮细胞的近管腔面，不能被机体免疫系统识别，其表达特点为极性表达，顶端分布，糖基化丰富。在大多数腺癌、血液系恶性肿瘤中MUC1呈异常过表达，可通过调控多个信号通路调节细胞恶性转化，是促进肿瘤发生与发展的重要癌基因。由于MUC1在肿瘤细胞中的表达糖基化不全，并失去极性，遍布于整个细胞表面，容易被抗体识别，因此，MUC1蛋白也是CAR-T细胞抗肿瘤治疗的一个理想靶点。
技术实现思路
本专利技术提供了一种抗CD19抗体和MUC1抗原肽的偶联物，将其与靶向MUC1的T淋巴细胞联合给药，可以获得同时靶向MUC1和CD19的治疗效果，对MUC1和CD19双抗原同时表达的肿瘤细胞具有较强的杀伤作用。本专利技术还提供了编码所述偶联物的核酸。包含所述核酸的表达载体也属于本专利技术的保护范围。本专利技术还提供了一种病毒，包含所述的表达载体。本专利技术还提供了所述核酸、或所述表达载体或所述病毒的用途，用于制备抗CD19抗体和MUC1抗原肽的偶联物。本专利技术还提供了所述偶联物、所述核酸、所述病毒在制备同时靶向MUC1和CD19的治疗肿瘤的药物组合中的应用。本专利技术还提供了一种治疗肿瘤的药物组合，对MUC1和CD19双抗原同时表达的肿瘤细胞具有较强的杀伤作用。本专利技术提供的抗CD19抗体和MUC1抗原肽的偶联物，所述偶联物包括抗CD19抗体重链与抗CD19抗体轻链-MUC1；所述抗CD19抗体轻链-MUC1为偶联有MUC1抗原肽的抗CD19抗体轻链；所述抗CD19抗体重链的氨基酸序列为SEQIDNO:1所示的序列；所述抗CD19抗体轻链-MUC1的氨基酸序列为SEQIDNO:2所示的序列。本专利技术还提供了编码所述的偶联物的核酸，包括编码所述抗CD19抗体重链的核苷酸和编码所述抗CD19抗体轻链-MUC1的核苷酸，其中，编码所述抗CD19抗体重链的核苷酸为SEQIDNO:3所示的序列，编码所述CD19抗体轻链-MUC1的核苷酸为SEQIDNO:4所示的序列。本专利技术提供的包含所述核酸的表达载体可以是慢病毒质粒，例如pGreenpuro。本专利技术提供的一种治疗肿瘤的药物组合，包括所述的偶联物与靶向MUC1的T淋巴细胞，所述靶向MUC1的T淋巴细胞的表面表达一种嵌合抗原受体，所述嵌合抗原受体包括如下的顺序连接的胞外结合区，铰链区和胞内信号区：特异性识别MUC1蛋白的SCFV(即MUC1SCFV)，IgD，CD28–OX40–CD3ζ。在本专利技术的一个具体实施方式中，所述嵌合抗原受体具有SEQIDNO:5所示的氨基酸序列；其对应的核苷酸序列为SEQIDNO:6。在本专利技术的另一个具体实施方式中，所述肿瘤是MUC1和CD19阳性的肿瘤。本专利技术方案具有以下优点：1)所述抗CD19抗体和MUC1抗原肽的偶联物可以通过慢病毒感染T淋巴细胞扩增后纯化获得，制备方法简单。2)所述抗CD19抗体和MUC1抗原肽的偶联物与靶向MUC1的T淋巴细胞联合给药，可以获得同时靶向MUC1和CD19的治疗效果，对MUC1和CD19双抗原同时表达的肿瘤细胞具有较强的杀伤作用。3)所述抗CD19抗体和MUC1抗原肽的偶联物可以作为一种开关，能可控地启动靶向MUC1的T淋巴细胞对CD19阳性肿瘤的杀伤作用或放大靶向MUC1的T淋巴细胞对MUC1和CD19双阳性表达肿瘤的杀伤作用。附图说明图1是本专利技术中抗CD19抗体和MUC1抗原肽的偶联物触发的靶向MUC1的T淋巴细胞对CD19阳性肿瘤细胞具有杀伤作用的设计示意图。图2是本专利技术中所述嵌合抗原受体(即AntiMUC1CAR)结构示意图。图3本专利技术提供的治疗肿瘤的药物组合对MUC1和CD19双阳小鼠的治疗效果。图4本专利技术提供的治疗肿瘤的药物组合对CD19阳性小鼠的治疗效果。图5本专利技术提供的治疗肿瘤的药物组合对MUC1阳性小鼠的治疗效果。图6是慢病毒表达载体pGreenpuro的结构示意图。具体实施方式实施例1抗CD19抗体和MUC1抗原肽的偶联物的制备1.合成和扩增1)合成编码抗CD19抗体重链的核苷酸序列(SEQIDNO:3)，以及编码所述CD19抗体轻链-MUC1的核苷酸序列(SEQIDNO:4)，均由苏州泓迅生物科技有限公司合成；2)将SEQIDNO:3，SEQIDNO:4扩增后，分别克隆到慢病毒表达载体pGreenpuro(购自爱迪基因(Addgene)公司)中，pGreenpuro的结构示意图如图6所示，SEQIDNO:3，SEQIDNO:4通过酶切位点BamHI和EcoRI连到载体里，分别获得重组慢病毒载体1，重组慢病毒载体2，经酶切鉴定获得了重组载体。步骤2)中的扩增与克隆步骤均可采用本领域常规实验条件进行完成，这对于本领域技术人员来说是可以实现的。2.慢病毒的包装本实施例包装慢病毒具体步骤如下:1)用含10％FBS的1640培养基培养293T细胞；然后将293T细胞以3x105/cm2的本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.抗CD19抗体和MUC1抗原肽的偶联物，其特征在于，所述偶联物包括抗CD19抗体重链，以及抗CD19抗体轻链‑MUC1；所述抗CD19抗体轻链‑MUC1为偶联有MUC1抗原肽的抗CD19抗体轻链；所述抗CD19抗体重链的氨基酸序列为SEQ ID NO:1所示的序列；所述抗CD19抗体轻链‑MUC1的氨基酸序列为SEQ ID NO:2所示的序列。
【技术特征摘要】
1.抗CD19抗体和MUC1抗原肽的偶联物，其特征在于，所述偶联物包括抗CD19抗体重链，以及抗CD19抗体轻链-MUC1；所述抗CD19抗体轻链-MUC1为偶联有MUC1抗原肽的抗CD19抗体轻链；所述抗CD19抗体重链的氨基酸序列为SEQIDNO:1所示的序列；所述抗CD19抗体轻链-MUC1的氨基酸序列为SEQIDNO:2所示的序列。2.编码权利要求1所述的偶联物的核酸。3.如权利要求2所述的核酸，其特征在于，包括编码所述抗CD19抗体重链的核苷酸与编码所述抗CD19抗体轻链-MUC1的核苷酸，编码所述抗CD19抗体重链的核苷酸为SEQIDNO:3所示的序列；编码所述抗CD19抗体轻链-MUC1的核苷酸为SEQIDNO:4所示的序列。4.一种表达载体，其特征在于，其包含权利要求2或3所述的核酸。5.如权利要求4所述的表达载...
【专利技术属性】
技术研发人员：刘未斌，刘曲波，李琼书，胡源，
申请(专利权)人：深圳市芥至和生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：广东,44
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