本发明专利技术提供了一种hIL‑12p35‑Fc融合蛋白及其编码基因、重组载体、宿主细胞及其在制备治疗自身免疫性疾病药物中的应用，属于基因工程和生物医药技术领域。本发明专利技术所述编码hIL‑12p35‑Fc融合蛋白包括人成熟hIL‑12p35肽片段和Fc片段。该融合蛋白由人成熟hIL‑12p35肽片段与Fc片段顺序连接获得，能表达得到可溶性的hIL‑12p35‑Fc融合蛋白，且该可溶性融合蛋白具有良好的治疗自身免疫性疾病的生物活性。
HIL-12p35-Fc fusion protein, coding gene, recombinant vector, host cell and its application
The present invention provides a fusion protein of hIL 12p35 Fc and its coding gene, recombinant vector, host cell and its application in the preparation and treatment of drugs for autoimmune diseases, belonging to the field of genetic engineering and biomedical technology. The encoding hIL 12p35 Fc fusion protein of the invention includes human mature hIL 12p35 peptide fragment and Fc fragment. The fusion protein was obtained by sequential ligation of mature human hIL 12p35 peptide fragment with Fc fragment. It can express soluble hIL 12p35 Fc fusion protein. The soluble fusion protein has good biological activity in the treatment of autoimmune diseases.
【技术实现步骤摘要】
hIL-12p35-Fc融合蛋白、编码基因、重组载体、宿主细胞及应用
本专利技术属于基因工程及生物医药
，具体涉及hIL-12p35-Fc融合蛋白及其编码基因、重组载体、宿主细胞及其在制备治疗自身免疫性疾病的药物中的应用。
技术介绍
自身免疫性疾病(autoimmunediseases)是指机体对自身抗原发生免疫反应而导致自身组织损害所引起的疾病如器官特异性自身免疫病。自身免疫性疾病涉及疾病之广，主要有器官特异性的自身免疫性疾病，如多发性脑脊髓硬化症(MS)、慢性淋巴性甲状腺炎、甲状腺功能亢进、胰岛素依赖型糖尿病、重症肌无力、慢性溃疡性结肠炎、恶性贫血伴慢性萎缩性胃炎、肺出血肾炎综合征、寻常天皰疮、类天皰疮、原发性胆汁性肝硬变、急性特发性多神经炎等；还包括系统性的身免疫性疾病，如系统性红斑狼疮(SLE)、类风湿性关节炎、系统性脉管炎、硬皮病、天疱疮、皮肌炎、混合结缔组织病、自身免疫性溶血性贫血、甲状腺自身免疫病、溃疡性结肠炎等。随着我国社会经济的发展，自身免疫病的发病率日益上升，而且自身免疫病后期对人们生产、生活乃至生命健康造成的危害是非常严重的。加强该领域的基础性研究将会进一步了解自身免疫性疾病的发生、发展、转归，进而提高对它的诊断、治疗和预防。这对保障人类健康生活，促进经济社会的发展均有着重要的理论及现实意义。IL-12家族成员不仅在感染及炎症过程中起着重要的调节作用，而且与脑脊髓炎、多发性硬化症、克罗恩病、类风湿性关节炎等多种自身免疫性疾病的发病和治疗密切相关。IL-12和IL-23分别是Th1和Th17诱导产生的关键分子，而Th1和Th17是两类自身免疫病中重要的致病因子，因此IL-12和IL-23已被用于自身免疫病的的治疗靶点。而IL-27和IL-35能分别有效地抑制Th17细胞产生和诱导调节性T和B细胞产生，而用于抑制自身免疫疾病如葡萄膜炎和多发性硬化症，目前研究IL-27和IL-35的生物制剂正成为研究热点。然而，目前人们仍然不能有效的获得具有良好生物活性的可溶性hIL-35。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种生理活性良好的可溶性hIL-12p35-Fc融合蛋白及其编码基因、重组载体、宿主细胞及其在制备治疗自身免疫性疾病的药物中的应用。本专利技术提供了一种hIL-12p35-Fc融合蛋白，所述hIL-12p35-Fc融合蛋白包括人成熟hIL-12p35肽片段和Fc片段；所述Fc片段为人免疫球蛋白链恒定区；所述Fc片段包括重链CH1、CH2、CH3、CH4中的两个以上的多结构域与免疫球蛋白铰链区的组合；所述免疫球蛋白包括IgA、IgD、IgE、IgG和IgM。优选的，所述人成熟hIL-12p35肽片段的氨基酸序列如SEQIDNo.5所示。优选的，所述Fc片段为IgG4Fc，所述IgG4Fc包括IgG4铰链区、CH2和CH3；所述IgG4Fc的氨基酸序列如SEQIDNo.7所示。优选的，所述hIL-12p35-Fc融合蛋白的氨基酸序列如SEQIDNo.10所示。本专利技术提供了编码hIL-12p35-Fc融合蛋白的基因，其特征在于，所述基因的核苷酸序列如SEQIDNo.8所示。本专利技术提供了包含上述基因的重组载体。优选的，所述重组载体的基础载体为昆虫表达载体pMIB。优选的，所述昆虫表达载体pMIB包含SEQIDNo.3所示核苷酸序列的信号肽编码序列。本专利技术提供了包含上述重组载体的重组宿主细胞。本专利技术还提供了上述hIL-12p35-Fc融合蛋白、基因、重组载体或重组宿主细胞在制备治疗自身免疫性疾病药物中的应用。优选的，所述自身免疫性疾病包括系统性红斑狼疮、多发性硬化、葡萄膜炎和牛皮癣中的一种或多种。本专利技术提供了一种治疗自身免疫性疾病的药物，所述药物包括上述hIL-12p35-Fc融合蛋白。优选的，所述药物还包括赋性剂、乳化剂、增溶剂、抗氧化剂、控释剂中的一种或多种。本专利技术还提供了上述hIL-12p35-Fc融合蛋白的制备方法，包括如下步骤：(1)培养上述重组宿主细胞，得到培养物；(2)从所述培养物中分离得到hIL-12p35-Fc融合蛋白。有益效果：本专利技术提供了一种hIL-12p35-Fc融合蛋白及其编码基因、重组载体、宿主细胞及其在制备治疗自身免疫性疾病药物中的应用。本专利技术所述编码hIL-12p35-Fc融合蛋白包括人成熟hIL-12p35肽片段和Fc片段。该融合蛋白由人成熟hIL-12p35肽片段与Fc片段顺序连接获得，能表达得到可溶性的hIL-12p35-Fc融合蛋白，且该可溶性融合蛋白具有良好的治疗自身免疫性疾病的生物活性。本专利技术分析编码hIL-12p35碱基表达偏性，结果显示：hIL-12p35碱基本身的信号肽不利于表达。因此，本专利技术使用Honeybeemelittinsecretion信号肽(SEQIDNo.3)来表达hIL-12p35。本专利技术还将hIL-12p35与hIgG4Fc段连接构成融合蛋白。hIgG4Fc可减少融合蛋白诱导机体的免疫刺激，hIgG4Fc段的加入不仅有利于蛋白的表达、纯化；还能有效提高蛋白在体内应用时的半衰期。另外，本专利技术在优选的方案中使用无血清培养的工程化HighFiveTM细胞株，无血清表达有利于融合蛋白表达、纯化。附图说明图1为本专利技术实施例1所述计算机分析IL-12A(hIL-12p35)的密码子偏好性结果图；图2为本专利技术实施例1所述纯化的p35-Fc融合蛋白与对照Fc蛋白的电泳结果图；图3为本专利技术实施例1所述应用抗p35抗体对纯化的蛋白进行Westernblot鉴定的结果图；图4为本专利技术实施例1所述应用抗IgGFc抗体对纯化的蛋白进行Westernblot鉴定的结果图；图5为本专利技术实施例2所述hIL-12p35-Fc抑制MRL/lpr小鼠B细胞增殖的实验结果图；图6为本专利技术实施例2所述hIL-12p35-Fc诱导MRL/lpr小鼠产生调节性B细胞而抑制浆细胞产生的实验结果图；图7为本专利技术实施例2所述hIL-12p35-Fc抑制MRL/lpr小鼠自身抗体产生的实验结果图；图8为本专利技术实施例2所述hIL-12p35-Fc抑制EAE小鼠T细胞对自身抗原肽MOG33-55反应的实验结果图；图9为本专利技术实施例2所述hIL-12p35-Fc诱导EAE小鼠产生调节性T细胞而抑制Th17产生的实验结果图；图10为本专利技术实施例2所述hIL-12p35-Fc抑制EAE小鼠疾病发生、发展的实验结果图；图11为本专利技术实施例2所述hIL-12p35-Fc抑制EAU小鼠T细胞对自身抗原反应的实验结果图；图12为本专利技术实施例2所述hIL-12p35-Fc诱导EAU产生调节性T细胞而抑制Th17产生的实验结果图；图13为本专利技术实施例2所述hIL-12p35-Fc抑制EAU小鼠临床症状的实验结果图。具体实施方式本专利技术提供了一种hIL-12p35-Fc融合蛋白，所述hIL-12p35-Fc融合蛋白包括人成熟hIL-12p35肽片段和Fc片段。该融合蛋白由人成熟hIL-12p35肽片段与Fc片段顺序连接获得，能表达得到可溶性的hIL-12p35-Fc融合蛋白，且该可溶性融合蛋白具有良好的治疗自身免疫性疾病的生物活性。在本专利技术中，所述人成熟hIL-12p35肽片段为hIL-12p本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种hIL‑12p35‑Fc融合蛋白，其特征在于，所述hIL‑12p35‑Fc融合蛋白包括人成熟hIL‑12p35肽片段和Fc片段；所述Fc片段为人免疫球蛋白链恒定区；所述Fc片段包括重链CH1、CH2、CH3、CH4中的两个以上的多结构域与免疫球蛋白铰链区的组合；所述免疫球蛋白包括IgA、IgD、IgE、IgG和IgM。
【技术特征摘要】
1.一种hIL-12p35-Fc融合蛋白，其特征在于，所述hIL-12p35-Fc融合蛋白包括人成熟hIL-12p35肽片段和Fc片段；所述Fc片段为人免疫球蛋白链恒定区；所述Fc片段包括重链CH1、CH2、CH3、CH4中的两个以上的多结构域与免疫球蛋白铰链区的组合；所述免疫球蛋白包括IgA、IgD、IgE、IgG和IgM。2.根据权利要求1所述的hIL-12p35-Fc融合蛋白，其特征在于，所述人成熟hIL-12p35肽片段的氨基酸序列如SEQIDNo.5所示。3.根据权利要求1所述的hIL-12p35-Fc融合蛋白，其特征在于，所述Fc片段为IgG4Fc，所述IgG4Fc包括IgG4铰链区、CH2和CH3；所述IgG4Fc的氨基酸序列如SEQIDNo.7所示。4.根据权利要求1所述的hIL-12p35-Fc融合蛋白，其特征在于，所述hIL-12p35-Fc融合蛋白的氨基酸序列如SEQIDNo.10所示。5.编码hIL-12p35-Fc融合蛋白的基因，其特征在于，所述基因的核苷酸序列如SEQIDNo.8所示。6.包含权利要求5所述基因的重组载体。7.根据权利要求6所述的重组载...
【专利技术属性】
技术研发人员：王仁喜，
申请(专利权)人：王仁喜，
类型：发明
国别省市：北京,11
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