纳米抗体-磁小体免疫磁珠复合物及其制备方法与应用技术

本发明专利技术提供一种纳米抗体‑磁小体免疫磁珠复合物及其制备方法与应用。将纳米抗体‑磁小体膜蛋白融合基因插入到自杀质粒的多克隆位点处得到重组质粒，将重组质粒转移至野生型磁螺菌中，获得的重组磁螺菌即可在磁小体膜上展示靶标纳米抗体(免疫磁珠复合物)。所述免疫磁珠复合物同时具有磁性分离和对相应抗原识别的双重功能，不仅可用于目标抗原的ELISA检测及应用，还可以用于目标抗原的吸附和富集。本发明专利技术基于基因工程技术制备出纳米抗体‑磁小体免疫磁珠复合物，相较传统的化学偶联方法具有生产成本低、周期短、易于纯化等明显优势。

Nano-antibody-magnetosome immunomagnetic bead complex and its preparation method and Application

The invention provides a nano-antibody magnetosome immune magnetic bead complex and a preparation method and application thereof. The recombinant plasmid was obtained by inserting the fusion gene of nano-antibody and magnetosome membrane protein into the polyclonal site of the suicide plasmid. The recombinant plasmid was transferred to wild-type magnetic spirilla. The obtained recombinant magnetic spirilla could display the target nano-antibody (immunomagnetic bead complex) on the magnetosome membrane. The immunomagnetic bead complex has dual functions of magnetic separation and antigen recognition. It can be used not only for ELISA detection and application of target antigen, but also for adsorption and enrichment of target antigen. The nano-antibody magnetosome immunomagnetic bead complex is prepared based on genetic engineering technology. Compared with the traditional chemical coupling method, the nano-antibody magnetosome immunomagnetic bead complex has obvious advantages such as low production cost, short cycle and easy purification.

【技术实现步骤摘要】
纳米抗体-磁小体免疫磁珠复合物及其制备方法与应用
本专利技术涉及基因工程领域，具体地说，涉及纳米抗体-磁小体免疫磁珠复合物及其制备方法与应用。
技术介绍
目前制备功能性蛋白-磁性颗粒的方法均为化学偶联法，所用的磁性颗粒一般由人工化学合成，反应步骤繁杂，反应条件苛刻，即先是内核材料的合成，再将内核材料包埋在壳中，整个过程需要严格的控制温度和pH。内核磁性颗粒可以通过共沉淀的方法，这个需要高的pH(pH＝10)，也可以通过温度在80-350℃的热分解法、溶胶凝胶法、水浴法等。可以采用表面活性剂组装到内核的表面，形成壳，表面活性剂有十二烷基硫酸钠、十六烷基三甲基溴化铵等。磁小体(magnetosome)是趋磁细菌(magnetotacticbacteria)胞内合成的磁性纳米粒子。磁小体的合成受基因的程序性控制，是一系列有序的酶在特定的生理环境下催化合成的产物，因此，磁小体的形状、大小、化学成分等都非常单一。微生物可以视为廉价的纳米磁性颗粒制造厂，它们所需的原始材料只有简单的碳源、氮源等，因此，磁小体的合成方便且环保。交联剂是将靶标蛋白偶联到化学合成的纳米颗粒表面的必需品，常用的化学交联剂有：戊二醛、碳化二亚胺盐酸盐等。磁小体是由微生物合成的，由磷脂双分子层包裹的内部为Fe3O4的磁性颗粒。外膜的包裹，即磁小体膜，使磁小体具备很好的分散性。磁小体的粒径一般分布在40-50nm之间，介于单磁畴范围，比人工合成的载药磁颗粒小1-20倍。丰富的膜蛋白镶嵌在磁小体膜的磷脂双分子层中，它们均可以作为外源蛋白、核酸、药物等的载体。其中，约有20种膜蛋白是趋磁细菌所特有的。上述两点说明了磁小体比人工合成的磁颗粒更具有优势。因此，磁小体在很多领域都表现出了潜在的应用价值，例如作为核酸和蛋白质大分子物质的载体、免疫分析、药物载体、磁共振成像、磁热疗、生物催化剂、信息存储等。纳米抗体是单域抗体，分子量约为14KD，大小约在2-4nm之间，是骆驼科动物体内重链抗体能够识别抗原的区域，即仅由一条短的核苷酸编码。因此，纳米抗体除了具备普通抗体的亲和力、特异性等优点，同时还具备稳定性高、分子量小、水溶性强、易于生物技术操作等优点。在医学研究中，纳米抗体除了可以作为药物，用于治疗炎症、神经性疾病、抗肿瘤、病毒中和制剂等；还可以作为药物的载体，融合到纳米颗粒上，制备迅速诊断的试剂盒、融合到低聚物蛋白上诊断病毒、偶联到蛋白上治疗人类的寄生虫病等；在基础应用中，纳米抗体可以作为蛋白的结合剂、无序蛋白和大分子复合物的分子伴侣等。另外，纳米抗体也被视为环境检测的工具，用以分析环境中的小分子污染物。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种纳米抗体-磁小体免疫磁珠复合物及其制备方法与应用。本专利技术构思如下：本专利技术以同源双交换的方法将外源基因整合到宿主菌(磁螺菌)的基因组上，选择的锚定蛋白为MamC，表达菌株在培养时无需外加抗生素，外源基因的转录和表达相较质粒稳定。本方法首次将能够识别环境中小分子污染物的纳米抗体展示在磁小体的表面。为了实现本专利技术目的，第一方面，本专利技术提供一种纳米抗体-磁小体融合蛋白，所述融合蛋白是由纳米抗体与磁小体膜蛋白之间直接串联连接或通过柔性Linker可操作地连接构成。其中，所述纳米抗体是利用噬菌体展示技术获得的能够特异性识别抗原的纳米抗体。所述磁小体膜蛋白来自于趋磁细菌。优选地，所述纳米抗体为四溴双酚A特异性纳米抗体，其氨基酸序列如SEQIDNO:6所示，编码所述纳米抗体的基因序列如SEQIDNO:4所示。优选地，所述磁小体膜蛋白的氨基酸序列如SEQIDNO:7所示，编码所述膜蛋白的基因序列如SEQIDNO:1所示。更优选地，所述纳米抗体-磁小体融合蛋白为四溴双酚A特异性纳米抗体-磁小体膜蛋白的融合蛋白。可将所述融合蛋白中的四溴双酚A特异性纳米抗体替换成具有识别其他抗原功能的纳米抗体。第二方面，本专利技术提供编码所述融合蛋白的基因，即纳米抗体-磁小体膜蛋白融合基因。第三方面，本专利技术提供一种聚核苷酸(融合基因)，包含磁小体膜蛋白基因的上游序列、磁小体膜蛋白基因、纳米抗体基因和磁小体膜蛋白基因的下游序列。所述融合基因的结构如下：磁小体膜蛋白基因的上游序列-磁小体膜蛋白基因-纳米抗体基因-磁小体膜蛋白基因的下游序列，或者，磁小体膜蛋白基因的上游序列-纳米抗体基因-磁小体膜蛋白基因-磁小体膜蛋白基因的下游序列。优选地，所述磁小体膜蛋白基因的上游序列如SEQIDNO:2所示，所述磁小体膜蛋白基因的下游序列如SEQIDNO:3所示。更优选地，所述聚核苷酸的核苷酸序列如SEQIDNO:5所示。第四方面，本专利技术提供含有所述融合蛋白基因或所述聚核苷酸的生物材料，所述生物材料包括但不限于重组DNA、表达盒、转座子、质粒载体、噬菌体载体、病毒载体或工程菌。优选地，本专利技术利用质粒pK18mobSacB构建所述融合蛋白基因的表达载体。即，将纳米抗体-磁小体膜蛋白融合基因插入到自杀质粒的多克隆位点处得到的重组质粒。第五方面，本专利技术提供一种重组磁螺菌，将所述融合蛋白基因或所述聚核苷酸通过质粒转移进磁螺菌中或通过基因工程手段整合到磁螺菌染色体上。优选地，所述磁螺菌为Magnetospirillumgryphiswaldensense，更优选M.gryphiswaldenseMSR-1。所述重组磁螺菌的构建方法如下：将SEQIDNO:5所示的聚核苷酸构建到pK18mobSacB载体的多克隆位点处，所得重组载体转移进M.gryphiswaldenseMSR-1，筛选重组子即得。第六方面，本专利技术提供了一种重组菌株及其构建方法，该重组菌株合成的纳米磁小体表面能够展示纳米抗体。具体为将纳米抗体基因与磁小体膜蛋白基因进行融合，融合基因插入到自杀质粒的多克隆位点处得重组质粒，将重组质粒转移至野生型磁螺菌中，获得的重组磁螺菌即可在磁小体膜上展示靶标纳米抗体。进一步地，本专利技术提供基于基因工程技术制备纳米抗体-磁小体免疫磁珠复合物的方法，包括以下步骤：1、构建携带锚定蛋白基因上游臂基因、纳米抗体-锚定蛋白的融合基因、锚定蛋白基因下游臂基因的重组自杀质粒；2、通过双亲接合实验将上述重组自杀质粒转移至野生型M.gryphiswaldense中，依次通过抗生素和蔗糖筛选，由菌落PCR验证以及磁响应验证确定筛选获得的阳性克隆菌株；3、将上述筛选获得的阳性克隆菌株经乳酸钠培养基摇瓶培养或深层发酵培养，收集细胞菌体，超声破碎细胞，磁性分离，PBS清洗得到高纯度纳米抗体-磁小体免疫磁珠复合物。第七方面，本专利技术提供一种纳米抗体-磁小体免疫磁珠复合物，所述免疫磁珠复合物是通过对所述重组磁螺菌进行培养，并从培养物中通过磁性吸附得到的。第八方面，本专利技术提供利用所述重组磁螺菌制备纳米抗体-磁小体免疫磁珠复合物的方法，包括在发酵培养基中对所述重组磁螺菌进行培养，并从培养物中分离纯化纳米抗体-磁小体免疫磁珠复合物。进一步地，所述方法包括离心收集菌体，然后重悬，超声破碎，最后通过磁性吸附得到纳米抗体-磁小体免疫磁珠复合物。在本专利技术的一个具体实施方式中，所述四溴双酚A特异性纳米抗体-磁小体免疫磁珠复合物的制备方法如下：(1)PCR扩增分别得磁小体膜蛋白基因SEQIDNO:1、所述磁小体膜蛋白基因的上游基因SEQ本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.纳米抗体‑磁小体融合蛋白，其特征在于，所述融合蛋白是由纳米抗体与磁小体膜蛋白之间直接串联连接或通过柔性Linker可操作地连接构成；其中，所述纳米抗体是利用噬菌体展示技术获得的纳米抗体；所述磁小体膜蛋白来自于趋磁细菌。

【技术特征摘要】
1.纳米抗体-磁小体融合蛋白，其特征在于，所述融合蛋白是由纳米抗体与磁小体膜蛋白之间直接串联连接或通过柔性Linker可操作地连接构成；其中，所述纳米抗体是利用噬菌体展示技术获得的纳米抗体；所述磁小体膜蛋白来自于趋磁细菌。2.根据权利要求1所述的融合蛋白，其特征在于，所述纳米抗体为四溴双酚A特异性纳米抗体，其氨基酸序列如SEQIDNO:6所示；所述磁小体膜蛋白的氨基酸序列如SEQIDNO:7所示。3.编码权利要求1或2所述融合蛋白的基因。4.一种聚核苷酸，其特征在于，其核苷酸序列如SEQIDNO:5所示。5.含有权利要求3所述基因或权利要求4所述聚核苷酸的生物材料，所述生物材料包括重组DNA、表达盒、转座子、质粒载体、噬菌体载体、病毒载体或工程菌。6.重组磁螺菌，其特征在于，将权利要求3所述基因或权利要求4所述聚核苷酸通过质粒转移进磁螺菌中或通过基因工程手段整合到磁螺菌染色体上；优选地，所述磁螺菌为Magnetospirillumgryphiswaldensen...

【专利技术属性】
技术研发人员：许艇，吴纱，田杰生，薛衔乐，
申请(专利权)人：中国农业大学，
类型：发明
国别省市：北京,11