一类用于连接B表位或半抗原的载体肽及含载体肽的免疫原在医药和免疫学的用途制造技术

本发明专利技术提供了一类结构类似的载体肽，可连接B细胞表位或肽半抗原构成肽免疫原，简化了免疫用抗原制备，在医药和免疫学有重要用途。将含本发明专利技术载体肽的肽免疫原免疫不同小鼠，显著增强B细胞表位或肽半抗原的免疫原性，产生高价与目标抗原蛋白特异结合的Th2抗体，用此肽免疫原免疫后通过杂交瘤技术或抗体库和单细胞等抗体制备技术可制备特异Th2抗体，显著增强偏向Th2的免疫调节，抑制酶活或相关蛋白功能，改善病症。同时本发明专利技术提供的载体肽及含载体肽的免疫原也可以用于重组微生物和转基因的动物或植物及其细胞，使其作为生产工厂，能生产疫苗或制作口服疫苗或生产特异抗体及改造物，用于防治Th1占优势或肽表位相关疾病包括但不限于糖尿病及并发症等和用于开发检测试剂。

Medical and immunological applications of a class of carrier peptides and immunogens containing carrier peptides used to link B epitopes or haptens

The present invention provides a class of carrier peptides with similar structure, which can connect B cell epitopes or peptide hapten to form peptide immunogen, simplify the preparation of immune antigens, and have important applications in medicine and immunology. Immunizing different mice with peptide immunogen containing the carrier peptide of the present invention can significantly enhance the immunogenicity of B cell epitope or peptide hapten, and produce Th2 antibody with high valence and specific binding to target antigen protein. After immunization with the peptide immunogen, specific Th2 antibody can be prepared by hybridoma technology or antibody library and single cell antibody preparation technology, which can significantly enhance the immune regulation biased to Th2 and inhibit enzyme activity. Or related protein function, improve the disease. At the same time, the carrier peptide and the immunogen containing the carrier peptide provided by the invention can also be used to reconstitute microorganisms and genetically modified animals or plants and their cells, so that they can be used as production factories to produce vaccines or oral vaccines or to produce specific antibodies and modifications, to prevent and treat diseases related to Th1 dominant or peptide epitopes, including but not limited to diabetes mellitus and complications, and to develop detection tests. Agent.

【技术实现步骤摘要】
一类用于连接B表位或半抗原的载体肽及含载体肽的免疫原在医药和免疫学的用途
本专利技术涉及免疫学、药学及医学相关领域。本专利技术涉及具有一类相似结构的载体肽和含此类载体肽的免疫原及其应用，尤其是此类载体肽用于和B细胞表位或肽半抗原即一种目标抗原蛋白的目标抗原位点共价连接成为肽免疫原，可以增强目标抗原位点(B细胞表位或肽半抗原)的免疫原性并可用于制备预防和治疗性疫苗和特异的与含B细胞表位或或肽半抗原的肽免疫原的目标抗原蛋白结合的多种类型抗体(可以是多抗，单克隆抗体及基于用此类肽免疫原免疫后用抗体库和单细胞等抗体制备技术制备的各种基因工程抗体)，含有该载体肽的肽免疫原及其偶联蛋白、融合蛋白及聚合物、偶联物以及基于用此类肽免疫原免疫后用抗体库和单细胞等抗体制备技术制备的各种基因工程特异抗体以及含有该载体肽的衍生物和类似物及在其基础上产生的各种特异抗体和抗体衍生物和类似物的药物及制剂，在预防和治疗CD4+减低和CD8+T细胞增加及Th1占优势的多种疾病等方面具有重要应用价值，由含此载体肽的肽免疫原制备的各种特异抗体及其衍生物和类似物还可用于检测相关目标抗原蛋白或目标抗原蛋白的主要片段，可开发为检测试剂。
技术介绍
人类和动物同样存在两个辅助性T淋巴细胞亚群，Th1细胞主要产生Th1类细胞因子IL-2、TNF-β和IFN-γ；Th2细胞主要产生IL-4、IL-5、IL-6、IL-10和IL-13。正常情况下，辅助性T淋巴细胞亚群Th1/Th2细胞处于平衡状态，但机体发生功能异常时，常表现出平衡偏向其中一方，此即为″Th1/Th2平衡漂移″。习惯上把Th1及其细胞因子占优势的状态称为Th1状态，Th2及其细胞因子占优势的状态称为Th2状态。当前判断疾病免疫发病机制中Th1或Th2细胞效应为主导的方法，主要是依据炎症组织局部细胞因子的表达，也可根据外周血清中抗体反应亚类的变化进行判断。根据干扰Th1或Th2细胞效应的各种环节后Th1或Th2细胞效应的变化来判断的与Th1偏高相关的人类感染疾病及自免疫性疾病有1型糖尿病及并发症和相关疾病，动脉粥样硬化，心血管病、老年痴呆、肾脏病，肾炎，类风湿性关节炎，反应性关节炎，多发性硬化，自身免疫性甲状腺炎，接触性皮炎，结节性红斑，习惯性流产等等。淋巴细胞包括T淋巴细胞(CD3+)、B淋巴细胞(CD3-CD19+)、NK细胞(CD3-CD16+CD56+)，其中，T细胞是淋巴细胞的主要组成。CD3+淋巴细胞代表全T淋巴细胞，它包括辅助/诱导T淋巴细胞(CD3+CD4+)、抑制/细胞毒T淋巴细胞(CD3+CD8+)、凋亡亚群(CD95+)等。辅助/诱导T淋巴细胞(CD3+CD4+)即CD4+T淋巴细胞是CD3和CD4全部双阳性的细胞，抑制/细胞毒T淋巴细胞(CD3+CD8+)即CD8+T淋巴细胞是CD3和CD8都为阳性的细胞。CD4+T细胞减少常见于恶性肿瘤、遗传性免疫缺陷症、艾滋病、应用免疫抑制剂等。CD8+T细胞增多见于1型糖尿病、系统性红斑狼疮、类风湿性关节炎、慢性活动性肝炎、传染性单核细胞增多症、恶性肿瘤及其他病毒感染等。CD8+、Th1类T细胞及细胞因子等偏高诱导发病，加重病情；CD4+、Th2类T细胞及细胞因子等增加则能减轻病症，甚至阻止发病，这与CD4+/CD8+和Th1/Th2的炎性及抗炎性反应有关。基于CD4+/CD8++和Th1/Th2漂移状态与各种疾病的关系，越来越多的研究正倾向于发现、开发能逆转或稳定CD4+/CD8+和Th1/Th2状态的药物和方法。表位是蛋白质抗原性的基础，蛋白质抗原可通过表位体现其免疫特性，就某一蛋白质而言，它含有多种表位如B细胞表位又称抗原决定簇(antigenicdeterminant，AD)，T辅助细胞(Th)表位等等，还有抑制性表位，毒性表位，交叉反应性表位等等。选择合适的表位并且通过合适的方法与其他肽或者蛋白质等连接以及用什么分子内和分子外佐剂及剂型，如何免疫等等才能得到理想的多肽或蛋白疫苗免疫后才产生特异的高效价(或高滴度)抗体是有巨大的挑战性的。小鼠体内Th1会产生IgG2a亚型抗体，Th2型则会产生IgG1和IgG2b亚型抗体，人体内Th1会产生IgG1亚型抗体，Th2型则会产生IgG2a亚型抗体，Th2亚型抗体可以增加Th2型细胞因子的产生并能治疗Th1偏高疾病，缓解病症，抗体及Th2亚型和Th1亚型抗体可以用于检测特点目标抗原。B细胞表位或肽半抗原的确定对多肽疫苗的合成、诊断试剂的制备、单克隆抗体的筛选等研究工作具有重要意义，但是B细胞表位或肽半抗原促使机体产生高滴度抗体的前提是要具有强免疫原性，效价达到8000以上制备单克隆抗体或基因工程抗体的关键。通常为了增加B细胞表位或肽半抗原的免疫原性，通过将B细胞表位或肽半抗原偶联到KLH、BSA等蛋白或者构建到大分子的融合蛋白上增加Th应答，该方法存在费时，耗钱，制备周期长等许多不利之处。免疫原诱导高的特异的抗体应答，必需包括B细胞表位(或肽半抗原)和Th细胞表位，这已经很清楚。如何选择合适的T辅助细胞(Th)表位及如何与B细胞表位或肽半抗原连接来显著提高B细胞表位或肽半抗原的免疫原性是一个世界难题，特别是用此免疫原生产制备治疗性疫苗和制备用于治疗疾病的特异亚型的单克降抗体或基因工程抗体是具有巨大的挑战的。肽-载体蛋白偶联多用于制备抗多肽类抗体，单独的多肽通常太小不足以激起充分的免疫反应，而带有很多抗原表位的载体蛋白有利于刺激辅助性T细胞，进一步诱导B细胞免疫反应，。免疫系统是将肽-蛋白作为一个整体来激起免疫反应的，因而产生的抗体中有针对多肽的，有针对链接剂的，也有针对载体蛋白的，因此通过用B细胞表位或肽半抗原和载体蛋白偶联或融合后免疫生物制备抗体特别是当今用于制备单克隆抗体和常用噬菌体抗体库等等就是制备基因工程抗体是通常常用的免疫技术，因此后期产生过多种类抗体使筛选需要的抗体变得较为困难，最普遍使用的载体钥孔血蓝蛋白(KLH，keyholelimpethemocyanin)比牛血清白蛋白(BSA)有更高的免疫原性，因而是最常被选用的载体蛋白。BSA(BovineSerumAlbumin)，即牛血清白蛋白，属于最稳定的和可溶的白蛋白，是一种很流行的弱抗原化合物载体蛋白。BSA的不利之处在于在很多实验中，它被当作封闭剂使用，如果多肽-BSA偶联物的抗血清用于这样的检测分析中，通常会出现假阳性，因为这些血清含有抗BSA的抗体。此外，KLH和BLH免疫后产生的抗体以Th1抗体偏多，用于连接B细胞表位或肽半抗原形成的免疫原是不适合用来治疗Th1偏高的疾病如1型糖尿病及并发症和相关疾病，动脉粥样硬化，心血管病、老年痴呆、肾脏病，肾炎，类风湿性关节炎，反应性关节炎，多发性硬化，自身免疫性甲状腺炎，接触性皮炎，结节性红斑，习惯性流产等等。因此寻找合适的载体分子且能产生偏Th2抗体的载体分子一直是探究的重要方向。P277肽是HSP60的437～460位的一段特异性多肽，共24个氨基酸，也是能与效应T细胞反应的抗原决定簇，是在T1DM预防中发挥作用的特异片段。DiaPep277目前以进入III期临床研究。已有实验研究发现按照国外DiaPep277相同的皮下给药方式，用P277肽进行本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一类组成结构类似的载体肽，其特征在于：载体肽含有一个多肽序列，该多肽序列含有氨基酸序列1和氨基酸序列2，氨基酸序列1和氨基酸序列2通过柔性肽或连接肽段的连接形成该类载体肽，所述氨基酸序列1是胰岛素瘤相关蛋白IA‑2的B细胞表位IA2(5)，所示氨基酸序列组成见SEQ ID No.1，所述氨基酸序列2是P277的C端的Th2细胞表位P2及其改构肽，所示氨基酸序列组成见SEQ ID No.2。

【技术特征摘要】
1.一类组成结构类似的载体肽，其特征在于：载体肽含有一个多肽序列，该多肽序列含有氨基酸序列1和氨基酸序列2，氨基酸序列1和氨基酸序列2通过柔性肽或连接肽段的连接形成该类载体肽，所述氨基酸序列1是胰岛素瘤相关蛋白IA-2的B细胞表位IA2(5)，所示氨基酸序列组成见SEQIDNo.1，所述氨基酸序列2是P277的C端的Th2细胞表位P2及其改构肽，所示氨基酸序列组成见SEQIDNo.2。2.根据权利要求1所述的柔性肽或连接肽接头为X1X2X3，------Xn，-----，X1X2X3X4X5、X1X2X3X4、X1X2X3、X1X2、X、GGGGG、GGGG、GGG、GGS、GG、G、K、KK或其他短肽。X1X2X3X4、X1X2X3X4X5、X1X2X3X4X5X6和X1X2X3------Xn，所述氨基酸序列见SEQIDNo.3、SEQIDNo.4、SEQIDNo.5和SEQIDNo.6，Xn为任一种氨基酸残基。n优选1-20阿拉伯数字。3.根据权利要求1-2所述的载体肽，当IA2(5)的C端和P2肽段的N端通过柔性肽或连接肽段的连接形成一类载体肽IP，IPA，IAP，2-IP，3-IP，4-IP，6-IP和I6P氨基酸序列分别见SEQIDNO.7、SEQIDNO.8、SEQIDNO.9、SEQIDNO.10、SEQIDNO.11、SEQIDNO.12、SEQIDNO.13和SEQIDNO.14，或将IA2(5)肽段FEYQD的C端和B细胞表位或肽半抗原通过柔性肽或连接肽共价连接后，再和Th2表位P2肽段的N端通过柔性肽或连接肽段的连接形成肽免疫原IA2(5)-B-P2-1等，IA2(5)-D41-P2-1和IA2(5)-O-P2-1的氨基酸序列分别见SEQIDNO.15和SEQIDNO.16。4.根据权利要求1-3所述的载体肽，当B分别为人DPP4、人黄嘌呤氧化酶的、人尿酸转运蛋白1和人乙酰胆碱酯酶的优势B细胞表位或合成肽半抗原时，和载体肽通过连接肽分别构成肽免疫原D41-IP(氨基酸序列见SEQIDNO.17)、D41-2-IP(氨基酸序列见SEQIDNO.18)、D41-3-IP(氨基酸序列见SEQIDNO.19)、D41-4-IP(氨基酸序列见SEQIDNO.20)、D41-6-IP(氨基酸序列见SEQIDNO.21)O-IP(氨基酸序列见SEQIDNO.22)、O-2-IP(氨基酸序列见SEQIDNO.23)、O-4-IP(氨基酸序列见SEQIDNO.24)，D41-IPA(氨基酸序列见...

【专利技术属性】
技术研发人员：李泰明，顾小骞，焦瑞，马艳洁，方金芝，程鹏，
申请(专利权)人：中国药科大学，
类型：发明
国别省市：江苏,32