CXCL9修饰的CAR-T结构及其应用制造技术

本申请属于肿瘤免疫治疗技术领域，具体涉及一种CXCL9修饰的CAR‑T结构及其应用专利申请事宜。所述CXCL9修饰的CAR‑T结构meso‑CAR‑CXCL9，具体结构为：CD8a‑meso‑CD28‑CD3Zeta‑P2A‑CXCL9。本申请中，发明专利技术人以肺癌模型为例，基于间皮素设计获得了CAR‑T‑CXCL9细胞。初步实验结果表明，与常规的CAR‑T细胞相比，改造后细胞具有更强的细胞因子分泌和细胞毒性的能力，可以明显增加肿瘤部位的免疫细胞浸润，并抑制了血管生成，进一步地，改造后的CAR‑T‑CXCL9细胞疗法减缓了肿瘤的生长，延长了小鼠的存活率，表现出优异的抗肿瘤活性。

【技术实现步骤摘要】
CXCL9修饰的CAR-T结构及其应用
本申请属于肿瘤免疫治疗
，具体涉及一种CXCL9修饰的CAR-T结构及其应用专利申请事宜。
技术介绍
肿瘤的免疫疗法中，CAR-T（ChimericAntigenReceptorT，嵌合抗原受体T）免疫疗法在治疗血液恶性肿瘤方面表现出良好的临床疗效，其中，靶向CD19的CAR-T细胞已被批准用于治疗CD19阳性淋巴瘤或白血病。但针对实体瘤的CAR-T细胞疗法受多种挑战的阻碍，尚未取得预期的疗效。其主要原因在于：T细胞在肿瘤部位的迁移和积累是实现其效应功能的第一步，但是实体瘤的隐蔽位置和复杂的微环境使免疫细胞难以进入。因此，如何改善实体瘤中肿瘤内T细胞浸润效果是解决CAR-T细胞疗法在实体瘤中应用的重要前提。已有研究认为，趋化因子及其受体在T细胞的迁移中起着至关重要的作用。而趋化因子在肿瘤部位的表达又与T细胞浸润、肿瘤控制和患者预后密切相关。因此，对于趋化因子-趋化因子受体网络的研究，对于控制T细胞迁移具有十分重要的技术意义。现有技术研究表明，CXCL9（干扰素γ诱导单核因子）作为CXC家族一员，在免疫细胞趋化中有重要作用，CXCL9的受体是CXCR3，其主要表达在活化的T细胞和NK细胞上。另外，CXCL9可以促进效应Th1和Th17细胞的极化，从而增强免疫应答和抗肿瘤作用。此外，还有报道认为，没有ELR（Glu-Leu-Arg）序列的CXCL9通过抑制血管生成，从而可以延迟肿瘤的进展；另外，研究认为CXCL9可用作预测患者免疫反应的生物标志物，其表达与肿瘤患者的预后更好相关。总之，目前关于CXCL9在肿瘤中作用的相关研究主要是通过构建过表达CXCL9肿瘤模型，诱导CXCL9在肿瘤中高表达或在肿瘤内注射重组CXCL9蛋白来抑制肿瘤生长的研究方式来确定其具体用途或者应用效果的。但尚未见到将CXCL9与CAR-T技术联合应用的相关报道。
技术实现思路
基于现有CXCL9和CAR-T技术研究，本申请目的在于提供一种利用CXCL9修饰改造CAR-T结构，从而为免疫细胞浸润及增强CAR-T细胞的抗肿瘤效果奠定一定技术基础。本申请的技术方案详述如下。CXCL9修饰的CAR-T结构，将其命名为：meso-CAR-CXCL9，具体结构为：依次连接的人CD8a分子信号肽（CD8a）、人间皮素抗体来源的scFv（meso）、人CD28分子跨膜区与CD28分子胞内区（CD28）、人CD3z分子胞内区（CD3Zeta），P2A连接序列（P2A）、CXCL9CDS区序列（CXCL9）；即：CD8a—meso—CD28—CD3Zeta（CD3ζ）—P2A—CXCL9；各片段的具体序列结构为：人CD8a分子信号肽（CD8a）序列（63bp，SEQIDNo.1）：ATGGCCTTACCAGTGACCGCCTTGCTCCTGCCGCTGGCCTTGCTGCTCCACGCCGCCAGGCCG；人间皮素抗体来源的scFv（meso）序列（873bp，SEQIDNo.2）：CAGGTGCAGCTGGTGCAGTCTGGGGCTGAGGTGAAGCGGCCTGGGGCCTCAGTGCAGGTTTCCTGCAGGGCATCTGGATACTCCATCAACACCTACTATATGCAATGGGTGCGACAGGCCCCTGGAGCAGGGCTTGAGTGGATGGGAGTAATCAACCCTAGTGGTGTCACAAGCTACGCACAGAAGTTCCAGGGCAGAGTCACCTTGACCAATGACACGTCCACGAACACAGTCTACATGCAGCTGAACAGCCTGACATCTGCAGACACGGCCGTGTATTACTGTGCGAGATGGGCATTGTGGGGGGATTTCGGGATGGACGTCTGGGGCAAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCCTCAGGTGGTGGTGGTTCTGGTGGTGGTGGTTCTGGTGGTGGTGGTTCCGGTGGTGGTGGTTCCGACATCCAGATGACCCAGTCTCCTTCCACCCTGTCTGCATCTATTGGAGACAGAGTCACCATCACCTGCCGGGCCAGTGAGGGTATTTATCACTGGTTGGCCTGGTATCAGCAGAAGCCAGGGAAAGCCCCTAAACTCCTGATCTATAAGGCCTCTAGTTTAGCCAGTGGGGCCCCATCAAGGTTCAGCGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCAGCCTGCAGCCTGATGATTTTGCAACTTATTACTGCCAACAATATAGTAATTATCCGCTCACTTTCGGCGGAGGGACCAAGCTGGAGATCAAAACCACGACGCCAGCGCCGCGACCACCAACACCGGCGCCCACCATCGCGTCGCAGCCCCTGTCCCTGCGCCCAGAGGCGTGCCGGCCAGCGGCGGGGGGCGCAGTGCACACGAGGGGGCTGGACTTCGCCTGTGAT；人CD28分子跨膜区与CD28分子胞内区（CD28）序列（204bp，SEQIDNo.3）：TTTTGGGTGCTGGTGGTGGTTGGTGGAGTCCTGGCTTGCTATAGCTTGCTAGTAACAGTGGCCTTTATTATTTTCTGGGTGAGGAGTAAGAGGAGCAGGCTCCTGCACAGTGACTACATGAACATGACTCCCCGCCGCCCCGGGCCCACCCGCAAGCATTACCAGCCCTATGCCCCACCACGCGACTTCGCAGCCTATCGCTCC；人CD3z分子胞内区（CD3Zeta）序列（336bp，SEQIDNo.4）：AGAGTGAAGTTCAGCAGGAGCGCAGACGCCCCCGCGTACCAGCAGGGCCAGAACCAGCTCTATAACGAGCTCAATCTAGGACGAAGAGAGGAGTACGATGTTTTGGACAAGAGACGTGGCCGGGACCCTGAGATGGGGGGAAAGCCGAGAAGGAAGAACCCTCAGGAAGGCCTGTACAATGAACTGCAGAAAGATAAGATGGCGGAGGCCTACAGTGAGATTGGGATGAAAGGCGAGCGCCGGAGGGGCAAGGGGCACGATGGCCTTTACCAGGGTCTCAGTACAGCCACCAAGGACACCTACGACGCCCTTCACATGCAGGCCCTGCCCCCTCGC；P2A连接序列（66bp，SEQIDNo.5）：GGAAGCGGAGCTACTAACTTCAGCCTGCTGAAGCAGGCTGGAGACGTGGAGGAGAACCCTGGACCT；人CXCL9基因（CDS区）序列（375bp，SEQIDNo.6）：ATGAAGAAAAG本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.CXCL9修饰的CAR-T结构，其特征在于，将其命名为：meso-CAR-CXCL9，具体结构为：/n依次连接的人CD8a分子信号肽CD8a、人间皮素抗体来源的scFv meso、人CD28分子跨膜区与CD28分子胞内区CD28、人CD3z分子胞内区CD3Zeta，P2A连接序列P2A、CXCL9的 CDS区序列CXCL9；/n即：CD8a—meso—CD28—CD3Zeta—P2A—CXCL9；/n各片段的具体序列结构为：/nCD8a序列如SEQ ID No.1所示；/nmeso序列如SEQ ID No.2所示；/nCD28序列如SEQ ID No.3所示；/nCD3Zeta序列如SEQ ID No.4所示；/nP2A序列如SEQ ID No.5所示；/nCXCL9序列如SEQ ID No.6所示。/n

【技术特征摘要】
1.CXCL9修饰的CAR-T结构，其特征在于，将其命名为：meso-CAR-CXCL9，具体结构为：
依次连接的人CD8a分子信号肽CD8a、人间皮素抗体来源的scFvmeso、人CD28分子跨膜区与CD28分子胞内区CD28、人CD3z分子胞内区CD3Zeta，P2A连接序列P2A、CXCL9的CDS区序列CXCL9；
即：CD8a—meso—CD28—CD3Zeta—P2A—CXCL9；
各片段的具体序列结构为：
CD8a序列如SEQIDNo.1所示；
meso序列如SEQIDNo.2所示；
CD28序列如SEQIDNo.3所示；
CD3Zeta序列如SEQID...

【专利技术属性】
技术研发人员：张毅，田永贵，
申请(专利权)人：郑州大学第一附属医院，
类型：发明
国别省市：河南;41