猪繁殖与呼吸综合症病毒基因工程亚单位疫苗制造技术

本发明专利技术公开了一种猪繁殖与呼吸综合症病毒基因工程亚单位疫苗，其包含融合蛋白以及医药学上可接受的载剂，所述融合蛋白具有SEQ ID NO:2所示序列。本发明专利技术提供的所述疫苗无任何毒性，安全性高，免疫原性好，能够在猪体内产生较强的体液免疫，免疫后的猪能够抵御强毒攻毒，并且还可以使用生物反应器大规模无血清悬浮培养制备，具有质控容易、批次间稳定、生产成本低等优点。

【技术实现步骤摘要】
猪繁殖与呼吸综合症病毒基因工程亚单位疫苗
本专利技术涉及一种基因工程疫苗，具体涉及一种猪繁殖与呼吸综合症病毒基因工程亚单位疫苗、其制备方法及应用，属于动物免疫药物

技术介绍
猪繁殖与呼吸综合症（PorcineReproductiveandRespiratorySyndrome，PRRS）又称蓝耳病，是由猪繁殖与呼吸综合症病毒（PorcineReproductiveandRespiratorySyndromeVirus，PRRSV）引起的高度接触性传染病，其临床症状主要表现为耳朵发绀、身体高热、厌食嗜睡、呼吸困难、淋巴结病、肺损伤以及妊娠母猪的流产、早产、死胎、弱胎和木乃伊胎等。PRRS具有感染时间较长、发病率较高、传播速度较快等特点，一旦发病，将很快地传播给其它猪群。该病于1987年首次在北美发现，此后在世界范围内广泛传播，给全世界的养猪产业造成了严重的经济损失。世界动物卫生组织（OIE）将其列为B类传染病。PRRSV属于套式病毒目（Nidovirales）、动脉炎病毒科（Arteriviridae）、猪动脉炎病毒属（Porartevirus），是单股正链RNA病毒，其病毒粒子呈球形或椭球形，直径为48-83nm，平均大小为50-65nm。PRRSV基因组全长约14.9-15.5kb，包含至少10个开放阅读框（OpenReadingFrame，ORF），分别命名为ORF1a、ORF1b、ORF2a、ORF2b、ORF3-7、以及新鉴定的ORF5a。ORF1a和ORF1b位于基因组的5’端，编码至少14种非结构蛋白。ORF2-7编码病毒的结构蛋白，主要包括GP2a、GP2b、GP3、GP4、GP5、GP5a、M和N蛋白。GP5蛋白是PRRSV的主要糖蛋白，具有跨膜特性，并参与PRRSV病毒的吸附过程，是病毒粒子中最重要的免疫保护性蛋白，在被感染的细胞中具有极强的中和作用，诱导高水平中和抗体产生，中和作用程度与GP5抗体效价有明显正相关性，在细胞免疫中起主要作用。非糖基化的M蛋白是PRRSV中最保守的结构蛋白，由ORF6基因编码，能够与GP5蛋白形成以二硫键连接的异源二聚体，是形成病毒粒子所必须的。M蛋白还可以增强感染机体对GP5蛋白的免疫反应性，使体液免疫应答和细胞免疫应答得到强化，促使中和抗体的产生速率加快。GP2a蛋白能够引起机体的T淋巴细胞发生增殖，GP2b蛋白保守性较高。GP3蛋白是PRRSV囊膜蛋白中糖基化最多的蛋白，能刺激机体产生PRRSV的中和抗体，具有较强的抗原性，在病毒感染过程中起重要作用。GP4蛋白在病毒粒子的组装和成熟中起到重要作用。GP2蛋白、GP3蛋白和GP4蛋白可形成异源多聚体，与病毒的入侵以及N端糖基化相关。现阶段我国主要使用灭活疫苗和减毒疫苗防治PRRS，但灭活疫苗和减毒疫苗都有不可回避的缺陷。灭活疫苗产生的中和抗体滴度较低，产生大量非中和抗体，可能引发ADE效应，增加PRRS感染的风险，达不到清除感染宿主细胞中病毒的要求，还存在免疫剂量大、免疫效果差、需要多次免疫等问题；而减毒疫苗安全性差，存在散毒和与田间野毒株重组导致新变异株产生的问题。
技术实现思路
本专利技术的主要目的在于提供一种猪繁殖与呼吸综合症病毒基因工程亚单位疫苗、其制备方法及应用，以克服现有技术中的不足。为实现前述专利技术目的，本专利技术采用的技术方案包括：本专利技术实施例提供了一种融合蛋白，其具有SEQIDNO:2所示序列或者与SEQIDNO:2的全长序列95％以上相同的序列。即，本专利技术实施例提供的所述融合蛋白的氨基酸序列可以是原始序列，增加或截短的序列。本专利技术实施例还提供了用于编码所述融合蛋白的基因。在一些实施方式中，所述的基因具有SEQIDNO:1所示序列或者与SEQIDNO:1的全长序列95％以上相同的序列。本专利技术实施例还提供了包含所述融合蛋白的编码基因的重组载体。在一些实施方式中，所述重组载体包括但不限于pFastBac1、pVL1393、pFastBacdual等，例如可以优选采用pFastBac1。本专利技术实施例还提供了包含所述融合蛋白的编码基因的宿主细胞。在一些实施方式中，所述宿主细胞选自昆虫细胞，例如Sf9细胞系，优选的，所述Sf9细胞系包括但不限于Sf9、HighFive或Sf21细胞，更优选为Sf9细胞。本专利技术实施例还提供了一种免疫组合物，其特征在于包括：所述的融合蛋白；以及，医药学上可接受的载剂。在一些实施方式中，所述医药学上可接受的载剂包括但不限于MONTANIDEISA206VG、MONTANIDEISA201VG、MONTANIDEISA15VG、液体石蜡、樟脑油、植物细胞凝集素等一种或者两种以上的组合，例如可以优选使用MONTANIDEISA201VG。本专利技术实施例还提供了一种融合蛋白的制备方法，其包括：提供所述融合蛋白的编码基因；将所述融合蛋白的编码基因克隆到穿梭载体中，获得含有目的基因的重组穿梭载体；将所述重组穿梭载体转化感受态细胞，并分离获得含有目的基因表达框的重组杆状病毒基因组质粒；以所述重组杆状病毒基因组质粒转染昆虫细胞，并获得重组杆状病毒；将所述重组杆状病毒接种昆虫细胞并进行培养，之后分离获得所述融合蛋白。在一些实施方式中，所述穿梭载体包括但不限于pFastBac1、pVL1393、pFastBacdual等，例如可以优选采用pFastBac1。在一些实施方式中，所述宿主细胞选自昆虫细胞，例如可以包括但不限于Sf9、HighFive或Sf21细胞等，优选为Sf9细胞。本专利技术实施例还提供了一种猪繁殖与呼吸综合症病毒基因工程亚单位疫苗的制备方法，其包括：采用前述的任一种方法制备融合蛋白，并将所述融合蛋白与医药学上可接受的载剂混合。本专利技术实施例还提供了所述融合蛋白或所述免疫组合物在制备猪繁殖与呼吸综合症病毒检测试剂，在生产用于在受试动物中诱导针对猪繁殖与呼吸综合症病毒抗原的免疫反应的药剂，或者，在生产用于预防动物受猪繁殖与呼吸综合症病毒感染的药剂中的用途。本专利技术实施例还提供了所述融合蛋白或所述免疫组合物在制备猪繁殖与呼吸综合症病毒基因工程亚单位疫苗中的用途。本专利技术实施例提供了一种猪繁殖与呼吸综合症病毒基因工程亚单位疫苗，其包含前述的任一种免疫组合物。进一步的，所述疫苗还可包含医药学上可接受的载剂。本专利技术实施例还提供了包含所述融合蛋白的编码基因的重组载体或宿主细胞在生产用于检测动物受猪繁殖与呼吸综合症病毒感染的试剂的用途。本专利技术实施例还提供了包含所述融合蛋白的编码基因的重组载体或宿主细胞在生产用于在受试动物中诱导针对猪繁殖与呼吸综合症病毒抗原的免疫反应的药剂的用途。本专利技术实施例还提供了包含所述融合蛋白的编码基因的重组载体或宿主细胞在生产用于预防动物受猪繁殖与呼吸综合症病毒感染的药剂的用途。本专利技术实施例还提供了一种诱导针对猪繁殖与呼吸综合症病毒抗原的免疫反应的方法，所述方法包括向受试本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.融合蛋白，其具有SEQ ID NO:2所示序列。/n

【技术特征摘要】
1.融合蛋白，其具有SEQIDNO:2所示序列。


2.用于编码权利要求1所述融合蛋白的基因。


3.如权利要求2所述的基因，其特征在于：所述基因具有SEQIDNO:1所示序列。


4.包含权利要求1所述融合蛋白的编码基因的重组载体或宿主细胞。


5.一种免疫组合物，其特征在于包括：权利要求1所述的融合蛋白；以及，医药学上可接受的载剂。


6.如权利要求5所述的免疫组合物，其特征在于：所述医药学上可接受的载剂包括MONTANIDEISA206VG、MONTANIDEISA201VG、MONTANIDEISA15VG、液体石蜡、樟脑油、植物细胞凝集素之中的任意一种或者两种以上的组合。


7.一种融合蛋白的制备方法，其特征在于包括：
提供权利要求1所述融合蛋白的编码基因；
将所述融合蛋白的编码基因克隆到穿梭载体中，获得含有目的基因的重组穿梭载体；
将所述重组穿梭载体转化感受态细胞，并分离获得含有目的基因表达框的重组杆状病毒基因组质粒；

【专利技术属性】
技术研发人员：曹文龙，孔迪，滕小锘，张大鹤，
申请(专利权)人：苏州世诺生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏;32