一种犬布鲁氏菌病诊断用融合蛋白抗原制造技术

本发明专利技术而提供一种布鲁菌病特异性融合蛋白抗原，其氨基酸序列如SEQ ID No:1所示。本发明专利技术所提供的融合蛋白抗原包含了多个布鲁氏菌优势外膜抗原表位，具有好的伸展性、稳定性和生物活性。利用本发明专利技术融合蛋白建立的犬布鲁氏菌病ELISA抗体检测试剂盒具有高的敏感性和特异性。特异性交叉实验显示，融合蛋白与大肠杆菌O157血清、大肠杆菌H7血清、沙门氏菌O抗原多价血清、小肠耶尔森氏菌血清和单增李斯特菌血清与阴性血清的OD450比值均小于1.5，犬布鲁菌阳性血清与阴性血清的OD450比值大于5，表明本发明专利技术所提供的融合蛋白不与感染了其他细菌的血清发生交叉反应，从而保证了检测的准确性。

【技术实现步骤摘要】
一种犬布鲁氏菌病诊断用融合蛋白抗原
本专利技术属于动物疫病检测
，具体涉及一种犬布鲁氏菌病诊断用融合蛋白抗原。
技术介绍
布鲁氏菌病(以下简称布病)是一种由布鲁氏菌引起的重要的人兽共患传染病,是国际动物卫生组织(OIE)规定必须通报的动物疫病，《中华人民共和国传染病防治法》规定其为乙类传染病，该病对我国养殖业、食品安全与人类健康构成重大威胁。目前布鲁氏菌属主要包括6个种，即羊种、牛种、猪种、绵羊附睾种、沙林鼠种和犬种布鲁氏杆菌。在我国主要流行羊种、牛种、猪种和犬种布鲁氏菌，均对人致病。人可通过接触患病动物的流产物、排泄物、乳、肉等经消化道和呼吸道感染。人布病的主要临床表现为波浪热、乏力、关节痛、神经痛、肝脾肿大、睾丸炎、流产等，还可引起脑膜炎、心内膜炎、脊柱炎等慢性病症，严重损伤身体，甚至丧失工作能力。犬布鲁氏菌病是由犬种布鲁氏菌(B.canis)引起的传染病，感染的主要动物是各种犬类，但还可感染人，是人布鲁氏菌病的重要传染源之一。1966年，从美国比格犬中首次分离到犬种布鲁氏菌，证明该菌可引起与其他种(牛、羊、猪)布鲁氏菌类似的疾病：流产、不育和生殖功能减退。可通过结膜、口腔和阴道的粘膜感染犬，口腔的最小感染剂量约为106个菌落形成单位(CFU)，而结膜最小感染剂量约为104至105个CFU，大部分感染是通过口鼻接触流产的胎儿及其分泌物而发生的，因为其中每毫升可能含有多达1010个细菌。同时，也可通过尿液或性交传播，这在犬养殖场中非常普遍。犬种布鲁氏菌感染宿主后，以游离细菌或在吞噬细胞内被运输到局部淋巴结，造成局部淋巴结肥大，淋巴和网状内皮增生以及炎症。如果细菌没有被免疫系统及时清除，它们就会通过血液和淋巴进行复制和传播，并在生殖器官、淋巴结和脾脏内持续增殖，导致生殖衰竭和非特异性、周期性发热。犬布鲁氏菌病在世界范围内呈地方流行，在美国东南部的农村地区和城市贫民窟，犬的血清阳性率较高，欧洲国家犬布病血清平均阳性率在3.7％，某些国家的阳性率可达11％。在非洲农村地区，犬布病阳性率较高，可达30％以上。亚洲国家的犬布病流行情况也比较严重，巴基斯坦的阳性率在10％左右，我国不同城市犬不病阳性率在0.5％至25％不等。犬布病的高感染率增加了人感染犬种布鲁氏菌的可能性，高风险人群包括兽医、动物饲养者、实验室工作人员等，处于妊娠期的妇女、儿童和免疫抑制病患者更加易感。在我国，近年来由犬种布鲁氏菌引发的人感染事件不断发生，而且随着宠物犬数量的不断增长，人面临的感染风险越来越大，对公共卫生安全和同一个健康理念造成极大挑战。与其他种类的布鲁氏菌(牛种、羊种和猪种)不同，犬布鲁氏菌外周膜脂多糖(LPS)中缺乏寡聚糖链(OPS)，而OPS是其他种类的布鲁氏菌的主要抗原表位，在其血清学检测中起着重要的作用。由于犬种布鲁氏菌缺乏OPS，极大限制了犬布鲁氏菌病检测技术的发展，我国目前商品化的产品较单一，仅有虎红平板凝集(RBT)试剂可用，它是以犬种布鲁氏菌的全菌作为抗原来检测血清中的抗体。全菌抗原的制备要涉及布鲁氏菌培养，人员感染的风险很大，而且需要在生物安全三级实验条件下操作，增加了制作成本。
技术实现思路
本专利技术为了解决现有技术的匮乏以及安全性低的缺点，而提供一种布鲁菌病特异性融合蛋白抗原，用于检测由犬种布鲁氏菌引起的布鲁氏菌病。本专利技术首先提供一种犬布鲁氏菌病诊断用融合蛋白抗原，其氨基酸序列如SEQIDNo:1所示。编码上述融合蛋白抗原的基因，其一种核苷酸序列如SEQIDNo:2所示。本专利技术还提供一种用于表达上述融合蛋白的原核表达载体，所述的核表达载体中插入了用于编码述融合蛋白抗原的核酸片段；作为实施例的一种具体记载，是在含有T7启动子的原核表达载体pET-28a中插入了编码上述融合蛋白抗原的基因。本专利技术还提供一种重组菌株，是转入了上述的原核表达载体。本专利技术另一个方面还提供一种犬布鲁菌病抗体ELISA试剂盒，它的诊断抗原为上述的布鲁氏菌病特异性融合蛋白；本专利技术再一个方面还提供一种犬布鲁菌病免疫胶体金试纸条,它的诊断抗原为上述的布鲁氏菌病特异性融合蛋白。本专利技术所提供的融合蛋白抗原包含了多个布鲁氏菌优势外膜抗原表位，具有好的伸展性、稳定性和生物活性。融合蛋白原核表达的密码子进行了优化，适用于在大肠杆菌BL21(DE3)的表达，并保持了融合蛋白的可溶性。临床样品检测结果表明，利用本专利技术融合蛋白建立的犬布鲁氏菌病ELISA抗体检测试剂盒具有高的敏感性和特异性，敏感性为92.5％，而特异性达到97.7％。特异性交叉实验显示，融合蛋白与大肠杆菌O157血清、大肠杆菌H7血清、沙门氏菌O抗原多价血清、小肠耶尔森氏菌血清和单增李斯特菌血清与阴性血清的OD450比值均小于1.5，犬布鲁菌阳性血清与阴性血清的OD450比值大于5，表明本专利技术所提供的融合蛋白不与感染了其他细菌的血清发生交叉反应，从而保证了检测的准确性。同时，本专利技术融合蛋白克服了传统的细菌培养安全性差、易对环境造成污染和感染人的缺点，用于犬布鲁氏菌病ELISA抗体检测试剂盒，还具有背景值低、重复性好、灵敏度高的优点，为犬布鲁菌病的快速、准确、特异诊断提供手段。附图说明图1：布鲁氏菌特异性融合蛋白亲疏水性分析图(数值越低表示亲水性越好)；图2：纯化的融合蛋白SDS-PAGE鉴定结果图；图3：犬布鲁氏菌病ELISA抗体检测试剂盒(融合蛋白)的ROC曲线图；图4：ELISA抗体检测试剂盒与粗糙型虎红平板凝集试验比较图；图5：免疫胶体金试纸条对犬布鲁氏菌病阳性和阴性血清的鉴别检测结果图。具体实施方式以下结合实施例和附图对本专利技术进行详细的描述。实施例1：布鲁氏菌主要膜蛋白B细胞抗原多肽的预测和筛选1、从NCBI(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)数据库中获取布鲁氏菌主要外膜蛋白BP26、Omp2b、Omp16、Omp25和Omp31的氨基酸序列，采用BepipredLinearEpitopePrediction、ABCpredpredictionServer软件对外膜蛋白的B细胞抗原表位进行预测，选择α螺旋、β折叠少、亲水性和抗原性好的序列作为优势抗原表位(见表1)。表1主要外膜蛋白B细胞抗原多肽预测信息表2、利用NCBI网站蛋白序列比对功能，将上述预测的多肽与数据库中的蛋白序列进行比对(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)，剔除与其他细菌的蛋白序列相似性(identity)达90％-100％的多肽。结果发现，多肽P2和P7与人苍白杆菌具有100％一致性，因此予以剔除。3、预测多肽对犬布鲁氏菌阳性和阴性标准血清的鉴别能力验证。将预测的抗原多肽分别偶联血蓝蛋白(KLH)作为抗原，采用间接ELISA法，用已知犬布鲁氏菌病阳和阴性血清对多肽进行筛选，具体步骤如下：(1)抗原包被：抗原多肽和KLH偶联抗原以100μ本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种犬布鲁氏菌病诊断用融合蛋白抗原，其特征在于，所述的融合蛋白抗原的氨基酸序列为SEQ ID No:1。/n

【技术特征摘要】
1.一种犬布鲁氏菌病诊断用融合蛋白抗原，其特征在于，所述的融合蛋白抗原的氨基酸序列为SEQIDNo:1。


2.一种基因，其特征在于，所述的基因用于编码权利要求1所述的融合蛋白抗原。


3.如权利要求2所述的基因，其特征在于，所述的基因的核苷酸序列为SEQIDNo:2。


4.一种原核表达载体，其特征在于，所述的原核表达载体插入了用于编码权利要求1所述的融合蛋白抗原的核酸片段。


5.如权利要求4所述的原核表达载体，其特征在于，所述的原核表达载体是在含有T7启动子的原核表达载体中插入了权利要求2所述的基因片段。

【专利技术属性】
技术研发人员：孙明军，孙翔翔，殷德辉，刘蒙达，樊晓旭，田莉莉，孙淑芳，邵卫星，范伟兴，
申请(专利权)人：中国动物卫生与流行病学中心，
类型：发明
国别省市：山东;37