非洲猪瘟病毒P12蛋白纳米颗粒及其制备方法与应用技术

本发明专利技术涉及一种非洲猪瘟病毒P12蛋白纳米颗粒及其制备方法与应用，所述蛋白纳米颗粒由蛋白质单体自组装形成，所述蛋白质单体为从氨基酸至羧基端依次包含金属硫蛋白、谷胱甘肽硫转移酶和P12蛋白的融合蛋白。本发明专利技术将GSTP1‑MT3蛋白与非洲猪瘟病毒的P12抗原进行融合表达，在毕赤酵母表达系统中，经亚铁离子的诱导，能够自发地形成蛋白纳米颗粒。通过在小鼠体内进行免疫原性测定，该P12蛋白纳米颗粒能引起很强的免疫反应，极有潜力开发成为新的安全有效的非洲猪瘟病毒疫苗。

【技术实现步骤摘要】
非洲猪瘟病毒P12蛋白纳米颗粒及其制备方法与应用
本专利技术涉及生物
，具体涉及一种非洲猪瘟病毒P12蛋白纳米颗粒及其制备方法与应用。
技术介绍
非洲猪瘟(Africanswinefever，ASF)是非洲猪瘟病毒(Africanswinefevervirus，ASFV)感染家猪或野猪引起的一种急性、出血性、高度接触性传染病，其特征是病程短、高热和出血性病变，急性感染死亡率高达100％，严重威胁全球养猪业。20世纪60年代，人们最先开始尝试使用ASF灭活疫苗，但是绝大部分无保护作用。2014年Blome等利用最新的佐剂联合ASF灭活疫苗免疫，仍然不能抵御强毒攻击。利用保护性抗原(p72、p54、CD2v等)制备的亚单位疫苗，免疫猪仅能提供部分的保护作用，联合使用免疫却不能提供保护作用。人们尝试使用保护性抗原表达的DNA疫苗和利用病毒载体表达的病毒载体疫苗，免疫效果同亚单位疫苗相似，也只能提供部分保护或无保护作用。ASFV的基因组约170-193kb，含有150-167个开放阅读框(Openreadingframes，ORFs)，编码150-200种蛋白质，其中约50多种是病毒的结构蛋白。ASFV病毒粒子为二十面体结构，直径约200nm，是由核壳蛋白包裹的病毒基因组DNA、病毒内囊膜、病毒衣壳和外囊膜组成的。囊膜蛋白是构成病毒颗粒的主要结构蛋白，也是重要的表面抗原，与宿主细胞嗜性、致病性、免疫原性密切相关。根据目前的研究，已知功能的ASFV囊膜蛋白主要有CD2v、p54、p12、p30、p17和p22等，然而，这些蛋白作为抗原免疫猪后，均不能获得有效的保护作用。例如，Neilan等人将P22与P30、P54、P72蛋白作为抗原对猪进行“鸡尾酒”式混合免疫，也没有获得有效保护作用。通过对现有技术进行讨论和分析，目前的非洲猪瘟病毒亚单位疫苗、核酸疫苗和病毒活载体疫苗的保护效力偏低。因此需要进一步研究非洲猪瘟病毒蛋白免疫原性，并利用新技术和新方法构建出安全有效的ASF疫苗。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种非洲猪瘟病毒P12蛋白纳米颗粒及其制备方法与应用。本专利技术将GSTP1-MT3蛋白与非洲猪瘟病毒的P12抗原进行融合表达，在毕赤酵母表达系统中，经亚铁离子的诱导，能够自发地形成蛋白纳米颗粒。通过在小鼠体内进行免疫原性测定，该P12蛋白纳米颗粒能引起很强的免疫反应，极有潜力开发成为新的安全有效的非洲猪瘟病毒疫苗。为此，第一方面，本专利技术提供一种非洲猪瘟病毒P12蛋白纳米颗粒，所述蛋白纳米颗粒由蛋白质单体自组装形成，所述蛋白质单体为从氨基酸至羧基端依次包含金属硫蛋白、谷胱甘肽硫转移酶和P12蛋白的融合蛋白。进一步，所述蛋白纳米颗粒由所述蛋白质单体经金属离子诱导而自组装形成，所述金属离子为Fe2+。金属硫蛋白是一类低分子量、高金属含量、富含半胱氨酸，普遍存在于生物界的蛋白质。通常地，金属硫蛋白可以经金属离子诱导而自组装形成融合蛋白，例如Cd2+、Gd3+、Cr3+、Ni2+、Fe2+、Mn2+、Co2+等，对于经不同金属离子诱导形成的自组装蛋白之间是否存在结构、性能差异，或者存在何种结构、性能差异，现有技术中并无通用性指导原则。本专利技术在研究过程中发现，对于本专利技术所提供的融合蛋白，相对于其他金属离子，在Fe2+离子诱导下自组装形成的蛋白纳米颗粒具有显著更优的免疫性能，这可能与其自组装形成的结构有关。进一步，所述金属硫蛋白为MT3，其氨基酸序列为SEQIDNO：1所示。进一步，所述谷胱甘肽硫转移酶为GSTP1，其氨基酸序列为SEQIDNO：2所示。进一步，所述金属硫蛋白和谷胱甘肽硫转移酶之间还包括可选的第一连接肽，所述谷胱甘肽硫转移酶和所述P12蛋白之间，还包括可选的第二连接肽。进一步，所述第一连接肽和所述第二连接肽各自独立地选自刚性连接肽或柔性连接肽，优选为柔性连接肽。在具体的实施方式中，所述连接肽为(GGGGS)n，n为1-4的整数。根据非洲猪瘟病毒中国流行株序列信息(AfricanswinefevervirusisolateChina/2018/AnhuiXCGQ,completegenome，GenBank:MK128995.1)，所述P12蛋白的氨基酸序列为SEQIDNO：3所示。进一步，所述蛋白质单体的氨基酸序列为SEQIDNO：4所示。进一步，所述蛋白质单体进一步包含信号肽，从而有助于本专利技术所述的蛋白质单体在宿主细胞中的分泌表达。在某些实施方式中，本专利技术的蛋白质单体在其氨基端包含信号肽。由于本专利技术在研究过程中发现，通过例如酵母的真核表达系统表达该蛋白质单体，相对于例如大肠杆菌的原核表达系统更有利于其表达、修饰、分泌和自组装，因此，在优选的实施方式中，所述信号肽可为α-factor分泌信号肽。进一步，所述蛋白质单体进一步包含蛋白标签。这类蛋白标签是本领域熟知的，例如His、Flag、MBP、HA、Myc等，并且本领域技术人员已知如何根据期望目的(例如，纯化、检测或示踪)选择合适的蛋白标签。在某些实施方式中，本专利技术的蛋白质单体包含His标签。在某些实施方式中，本专利技术的蛋白质单体在其羧基端包含蛋白标签。本专利技术的第二方面，提供一种核酸，其编码本专利技术所述的蛋白质单体。进一步，所述核酸为SEQIDNO：5的第13-987位，或者SEQIDNO：5的第13-1005位。本专利技术的第三方面，提供一种载体，其包含本专利技术所述的核酸。在某些实施方式中，所述载体为质粒、粘粒或噬菌体。本专利技术的第四方面，提供一种宿主细胞，其包含本专利技术所述的核酸和/或载体，和/或表达本专利技术所述的蛋白质单体。所述宿主细胞包括原核细胞例如大肠杆菌细胞，以及真核细胞例如酵母细胞，昆虫细胞，植物细胞和动物细胞(如哺乳动物细胞，例如小鼠细胞、人细胞等)等。在优选的实施例中，所述宿主细胞为酵母细胞。本专利技术的第五方面，提供本专利技术所述蛋白纳米颗粒的制备方法，其包括，在允许所述蛋白质单体表达的条件下，培养本专利技术所述的宿主细胞；在所述培养过程加入金属离子进行诱导；和对培养得到的宿主细胞培养物进行蛋白纯化，即制备得到所述蛋白质单体经自组装形成的蛋白纳米颗粒。进一步，所述金属离子为Fe2+，所述金属离子的浓度为0.01-0.5mM，优选为0.5mM。进一步，所述培养的过程中，所用培养基的pH为6.5-8.0，优选为8.0。本专利技术的第六方面，提供一种免疫原性组合物或疫苗，其包括本专利技术所述的蛋白纳米颗粒，和/或本专利技术所述的核酸，和/或本专利技术所述的载体，和/或本专利技术所述的宿主细胞。进一步，所述免疫原性组合物或疫苗的活性成分为本专利技术所述的蛋白纳米颗粒，和/或本专利技术所述的核酸，和/或本专利技术所述的载体，和/或本专利技术所述的宿主细胞。进一步，所述免疫原性组合物或疫苗还包含佐剂、药学上可接受的载体、药学上可接受的赋形剂中的一种或两种以上。本专利技术的第七方面，提供本专利技术所述的蛋白纳米颗粒、本专利技术所述的核酸、本专利技术所述的载体本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种非洲猪瘟病毒P12蛋白纳米颗粒，其特征在于，所述蛋白纳米颗粒由蛋白质单体自组装形成，所述蛋白质单体为从氨基酸至羧基端依次包含金属硫蛋白、谷胱甘肽硫转移酶和P12蛋白的融合蛋白。/n

【技术特征摘要】
1.一种非洲猪瘟病毒P12蛋白纳米颗粒，其特征在于，所述蛋白纳米颗粒由蛋白质单体自组装形成，所述蛋白质单体为从氨基酸至羧基端依次包含金属硫蛋白、谷胱甘肽硫转移酶和P12蛋白的融合蛋白。


2.如权利要求1所述的蛋白纳米颗粒，其特征在于，所述蛋白纳米颗粒由所述蛋白质单体经金属离子诱导而自组装形成，所述金属离子为Fe2+。


3.如权利要求1所述的蛋白纳米颗粒，其特征在于，所述金属硫蛋白为MT3，其氨基酸序列为SEQIDNO：1所示；优选地，所述谷胱甘肽硫转移酶为GSTP1，其氨基酸序列为SEQIDNO：2所示。


4.如权利要求1所述的蛋白纳米颗粒，其特征在于，所述金属硫蛋白和谷胱甘肽硫转移酶之间还包括可选的第一连接肽；优选地，所述谷胱甘肽硫转移酶和所述P12蛋白之间，还包括可选的第二连接肽；
优选地，所述第一连接肽和所述第二连接肽各自独立地选自刚性连接肽或柔性连接肽，优选为柔性连接肽。


5.如权利要求1所述的蛋白纳米颗粒，其特征在于，所述蛋白质单体进一步包含信号肽和/或蛋白标签。


6.一种生物材料，其特征在于，所述生物材料为：
(i)编码权利要求1-5任一项所述的蛋白质单体的核酸；优选地，所述核酸为SEQIDNO：5的第13-987位，或者SEQIDNO：5的第13-1005位；
(ii)包含(i)所述核酸的载体；或
(iii)包含(i)所述核...

【专利技术属性】
技术研发人员：林坚，朱新杰，李紫晨，郑梦竹，沈显贵，
申请(专利权)人：北京四纬生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：北京;11