新冠状病毒检测用多位点重组抗原及其制备方法技术

本发明专利技术涉及一种新冠状病毒检测用多位点重组抗原及其制备方法，通过蛋白序列比对的方法挑选出S，N，E，M4种蛋白的具有极强的抗原决定基，是重要的免疫激活感染体产生抗体的重要蛋白片段，感染体会优先释放相应的抗体，同时利用GSSSG链接肽链形成了拥有多位点的具有免疫原性特异性强的抗原蛋白，该重组蛋白区别于其他单一蛋白序列，融合了新冠状病毒的4种基础蛋白的的片段，串联在了一起，该重组抗原可以特异性的识别只有新冠病毒感染的血清种的抗体，同时由于拥有4个不同蛋白的片段，极大的提高其灵敏度和特异性，是检测新冠病毒抗体的最佳候选抗原。

【技术实现步骤摘要】
新冠状病毒检测用多位点重组抗原及其制备方法
本专利技术属于抗原制备领域，具体涉及一种新冠状病毒检测用多位点重组抗原及其制备方法。
技术介绍
新型冠状病毒属于β属的冠状病毒，单链正义RNA病毒，有包膜，颗粒呈圆形或椭圆形，常为多形性，直径60-140nm，其基因特征与SARSr-CoV和MERSr-CoV有一定的区别，表现出了一定的独特性，目前研究显示与蝙蝠SARS样冠状病毒同源性达85％以上。因此其具有超高致病率和传播性，已经引起了世界卫生组织的高度重视，并成为全球公共卫生的重大威胁。冠状病毒的独特外表主要体现在病毒包膜外，有类似的棒状的子粒结构，类似于欧洲中世纪的国王王冠的造型，因此得名冠状病毒。其中主要包括刺突糖蛋白(S蛋白)，核衣壳蛋白(N蛋白)，包膜糖蛋白(E蛋白)，膜蛋白(M蛋白)以及核糖核酸组成。S蛋白是病毒表面包膜的棒-球形糖基化蛋白，形成了特有的冠状形态，也是冠状病毒侵袭宿主细胞的主要媒介，通过与人类细胞表面AEC2蛋白相结合，协助新冠病毒入侵到细胞并造成破坏。NP蛋白病毒核内唯一的蛋白，是病毒表达量最多的蛋白，可以与病毒RNA相结合，识别基因组的包膜信号将包膜蛋白打包成病毒颗粒，也是冠状病毒最重要的抗原之一。但是目前尚未有适合检测新冠病毒抗体的候选抗原。
技术实现思路
为解决现有技术中存在的问题，本专利技术提供一种新冠状病毒检测用多位点重组抗原，其特征在于，所述新冠状病毒检测用多位点重组抗原的氨基酸序列如SEQIDNO.1所示。本专利技术还提供了一种新冠状病毒检测用多位点重组抗原，其制备方法如下：(1)：通过蛋白序列比对的方法挑选出S，N，E，M四种蛋白的具有极强的抗原决定基并采用基因克隆技术合成新冠状病毒检测用多位点基因片段；(2)：将合成的新冠状病毒检测用多位点基因片段转入pGEX-4T-2质粒载体中再导入BL21(D3)菌株中；(3)：利用IPTG为诱导剂，促使细菌大量表达目标蛋白，再经过GSH树脂进行纯化即得所述新冠状病毒检测用多位点重组抗原。在上述任一方案中优选的是，所述新冠状病毒检测用多位点基因片段的氨基酸序列如SEQIDNO.2所示。在上述任一方案中优选的是，所述pGEX-4T-2质粒载体的氨基酸序列如SEQIDNO.3所示。在上述任一方案中优选的是，四中蛋白提取位置分别为：蛋白1-260：MFVFLVLLPLVSSQCVNLTTRTQLPPAYTNSFTRGVYYPDKVFRSSVLHSTQDLFLPFFSNVTWFHAIHVSGTNGTKRFDNPVLPFNDGVYFASTEKSNIIRGWIFGTTLDSKTQSLLIVNNATNVVIKVCEFQFCNDPFLGVYYHKNNKSWMESEFRVYSSANNCTFEYVSQPFLMDLEGKQGNFKNLREFVFKNIDGYFKIYSKHTPINLVRDLPQGFSALEPLVDLPIGINITRFQTLLALHRSYLTPGDSSSG；E蛋白1-47MYSFVSEETGTLIVNSVLLFLAFVVFLLVTLAILTALRLCAYCCNIV；N蛋白291-359：LIRQGTDYKHWPQIAQFAPSASAFFGMSRIGMEVTPSGTWLTYTGAIKLDDKDPNFKDQVILLNKHIDA；M蛋白20-157：WNLVIGFLFLTWICLLQFAYANRNRFLYIIKLIFLWLLWPVTLACFVLAAVYRINWITGGIAIAMACLVGLMWLSYFIASFRLFARTRSMWSFNPETNILLNVPLHGTILTRPLLESELVIGAVILRGHLRIAGHHLG。本项专利技术通过蛋白序列比对的方法挑选出S，N，E，M4种蛋白的具有极强的抗原决定基，是重要的免疫激活感染体产生抗体的重要蛋白片段，感染体会优先释放相应的抗体，同时利用GSSSG链接肽链形成了拥有多位点的具有免疫原性特异性强的抗原蛋白，该重组蛋白区别于其他单一蛋白序列，融合了新冠状病毒的4种基础蛋白的的片段，串联在了一起，该重组抗原可以特异性的识别只有新冠病毒感染的血清种的抗体，同时由于拥有4个不同蛋白的片段，极大的提高其灵敏度和特异性，是检测新冠病毒抗体的最佳候选抗原。具体实施方式为了更进一步了解本专利技术的
技术实现思路
，下面将结合具体实施例详细阐述本专利技术。本专利技术提供一种新冠状病毒检测用多位点重组抗原，其特征在于，所述新冠状病毒检测用多位点重组抗原的氨基酸序列如SEQIDNO.1所示。本专利技术还提供了一种新冠状病毒检测用多位点重组抗原，其制备方法如下：(1)：通过蛋白序列比对的方法挑选出S，N，E，M四种蛋白的具有极强的抗原决定基并采用基因克隆技术合成新冠状病毒检测用多位点基因片段；(2)：将合成的新冠状病毒检测用多位点基因片段转入pGEX-4T-2质粒载体中再导入BL21(D3)菌株中；(3)：蛋白制备方法：大肠杆菌培养，1(甘油菌)：100体积加LB培养基接种，37℃摇床(200pm)过夜培养；1：10体积加LB培养基继续扩增，37℃摇床(200pm)培养1h；加入1mM的IPTG诱导2h，30℃，然后回收细菌并裂解，离心去除上清，收集沉淀；加入WashBuffer，利用微量移液器混匀，离心10000转，10分钟，清洗两次；离心沉淀中加入(20菌液：1)平衡液，摇床反应4℃过夜(或者室温1h)，让沉淀充分溶解(透清)；离心10000转，10分钟，取上清；用平衡液平衡含有GST亲和的树脂柱子，反复冲洗2次；将含有样品的缓冲液加入到已经平衡好的树脂柱子中；上样完毕后继续用平衡缓冲液淋洗至基线；再用10倍柱床体积PreScissionProtease的酶切缓冲液平衡柱子。PreScissionProtease的酶切缓冲液的组分为50mMTris-HCl，150mMNaCl，1mMEDTA，1mMDTT，pH7.5；准备PreScissionProtease：约每毫克GST标签蛋白使用20UPreScissionProtease。对于8mgGST标签蛋白需使用160UPreScissionProtease，用PreScission酶切缓冲液稀释至与凝胶柱相同的体积，即1ml；将稀释好的1mlPreScissionProtease导入到纯化柱中，4℃保持4-8h(为确保酶切完全，可以4℃酶切过夜)；用1倍柱床体积的PreScissionProtease酶切缓冲液洗涤，重复三次，收集每次的洗涤液。洗脱液中含有切除了GST标签的目的新冠病毒重组蛋白，而GST标签和带有GST标签的PreScissionProtease则仍然结合在凝胶柱上。在上述任一方案中优选的是，所述新冠状病毒检测用多位点基因片段的氨基酸序列如SEQIDNO.2所示。在上述任一方案中优选的是，所述pGEX-4T-2质粒载体的氨基酸序列如SEQIDNO.3所示。在上述任一方案中优选的是，四中蛋白提取位置分别为：蛋白1-260：MFVFLVLL本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种新冠状病毒检测用多位点重组抗原，其特征在于，所述新冠状病毒检测用多位点重组抗原的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。/n

【技术特征摘要】
1.一种新冠状病毒检测用多位点重组抗原，其特征在于，所述新冠状病毒检测用多位点重组抗原的氨基酸序列如SEQIDNO.1所示。


2.根据权利要求1所述的一种新冠状病毒检测用多位点重组抗原，其特征在于，制备方法如下：
(1)：通过蛋白序列比对的方法挑选出S，N，E，M四种蛋白的具有极强的抗原决定基并采用基因克隆技术合成新冠状病毒检测用多位点基因片段；
(2)将合成的新冠状病毒检测用多位点基因片段转入pGEX-4T-2质粒载体中再导入BL21(D3)菌株中；
(3)利用IPTG为诱导剂，促使细菌大量表达目标蛋白，再经过GSH树脂进行纯化即得所述新冠状病毒检测用多位点重组抗原。


3.根据权利要求2所述的一种新冠状病毒检测用多位点重组抗原，其特征在于，所述新冠状病毒检测用多位点基因片段的氨基酸序列如SEQIDNO.2所示。


4.根据权利要求2所述的一种新冠状病毒检测用多位点重组抗原，其特征在于，所述pGEX-4T-2质粒载体的氨基酸序列如SEQIDNO.3所示。


5.根据权利要求2所述的一种新冠状病毒检测用多位点重组抗原，其特征在于，四中蛋白提取位置分别为：蛋白1-260：...

【专利技术属性】
技术研发人员：赵钢，
申请(专利权)人：苏州诺威百奥生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏;32