一种蛋白及其在促进皮肤成纤维细胞迁移、抗菌和创口修复中的应用制造技术

本发明专利技术涉及一种蛋白及其在促进皮肤成纤维细胞迁移、抗菌和创面愈合中的应用。该蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示，其中，自氮端起第2至7个氨基酸为组氨酸标签。

【技术实现步骤摘要】
一种蛋白及其在促进皮肤成纤维细胞迁移、抗菌和创口修复中的应用
本专利技术涉及一种蛋白，特别是其在促进皮肤成纤维细胞迁移、抗菌和创口修复中的应用。
技术介绍
伤口是正常皮肤结构和功能及软组织结构遭到破坏的结果，可由多种机制和病因造成。一般情况下，伤口会遵循有序的生理过程进行愈合。然而，部分伤口，尤其因溃疡和感染造成的慢性伤口，愈合难度很高。口腔溃疡则为口腔内及嘴唇周围黏膜或上皮破损肿痛的一类疾病，其病因主要包括物理性或者化学性损伤、微生物感染、化学药物治疗和放射性治疗引起的炎症反应。大部分口腔溃疡在发病过程中存在出血和微生物感染的现象。上述的这些疾病严重影响患者身体健康以及生活质量。创面愈合是指由于致伤因子的作用造成组织缺失后，局部组织通过再生、修复、重建等进行皮肤修补的一系列病理生理过程。创面愈合包括凝血期、炎症期以及修复期，其中，止血、防止细菌的感染以及快速填补组织缺损是促进创面愈合最为关键的问题。
技术实现思路
本专利技术之一提供了一种蛋白，其氨基酸序列如SEQIDNo.1所示，其中，自氮端起第2至7个氨基酸为组氨酸标签。在一个具体实施方式中，所述组氨酸标签替换为FLAG标签和/或AVI标签。本专利技术之二提供了一种编码如本专利技术之一所述的蛋白的核酸。在一个具体实施方式中，所述核酸的序列如SEQIDNo.2所示。本专利技术之三提供了一种携带有如本专利技术之二所述的核酸且能表达如本专利技术之一所述蛋白的重组微生物。在一个具体实施方式中，所述重组微生物的出发菌株选自埃希氏菌属(Escherichia)和酿酒酵母属(Saccharomyce)中的至少一种。在一个具体实施方式中，所述重组微生物选自大肠杆菌(Escherichiacoli)、酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)和毕赤酵母(Pichiapastoris)中的至少一种。本专利技术之四提供了一种组合物，其包括如本专利技术之一所述的蛋白和药学上可接受的载体。在一个具体实施方式中，所述药学上可接受的载体选自水、磷酸缓冲液、生理盐水、生理上可匹配的缓冲液、生理上可匹配的溶液和生理上可匹配的悬浮液中的至少一种。在一个具体实施方式中，所述蛋白在所述组合物中的浓度为100微克/毫升至1毫克/毫升。本专利技术之五提供了本专利技术之一所述的蛋白、本专利技术之二所述的核酸、本专利技术之三中任意一项所述的重组微生物和本专利技术之四所述的组合物中的至少一种在成纤维细胞迁移、组织修复、创口修复及抑菌中的至少一种的应用。在一个具体实施方式中，所述应用为在抑制丙酸杆菌属(Propionibacterium)、葡萄糖菌属(Staphylococcus)、芽孢杆菌属(Bacillus)和念珠菌属(Candida)中的至少一种微生物的应用。在一个具体实施方式中，所述应用为在抑制痤疮丙酸杆菌(Propionibacteriumacnes)、金黄色葡萄糖菌(Staphylococcusaureus)、枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)以及白色念珠菌(Candidaalbicans)中的至少一种的应用。本专利技术的有益效果：本专利技术人工合成了一种DNA序列，并将其克隆到表达质粒中，利用大肠杆菌进行重组表达。然后，经离子交换层析和组氨酸亲和层析方法分离纯化，得到纯度高于95％的蛋白。体外细胞实验证明，本专利技术的蛋白能有效促进皮肤成纤维细胞迁移。将其用于动物皮肤创口模型，与对照组相比，该蛋白能显著促进皮肤创口或创面的修复与愈合。此外，该蛋白还能抑制有害微生物金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、白色念珠菌以及痤疮丙酸杆菌的生长。因此，本专利技术获得的蛋白可以在伤口表面形成覆膜、减少有害细菌的数量同时促进皮肤细胞迁移，从而降低伤口感染及加快皮肤创口，尤其是难愈性皮肤创口或者大面积伤口的愈合，最终实现皮肤创口快速修复，从而有效提供病人的生存和生活质量。本专利技术的蛋白(SEQIDNo.1)分子量约为28.5千道尔顿，且不存在分子内/间二硫键，因而，可通过原核或者真核基因工程宿主进行大规模表达及分离纯化，并在使用过程中抑杀有害细菌/真菌，减少这些有害菌造成创口感染，便于临床治疗和日常皮肤护理。附图说明图1.蛋白NC2K的凝胶电泳检测分析该图为蛋白NC2K的凝胶电泳检测。重组大肠杆菌菌株在LB培养基中生长到对数生长期，然后利用终浓度为1毫摩尔的异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)在37℃下进行诱导表达6小时。通过冷冻高速离心收集菌体，加入裂解缓冲液(250mMTris-HCl，pH6.8；10％(W/V)十二烷基硫酸钠；0.5％(W/V)溴酚蓝；50％(V/V)甘油；5％(W/V)β-巯基乙醇)重悬菌体，并至于95℃水中孵育10分钟。然后，15000转/分钟(rpm)离心10分钟。取上清液进行10％的聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)。结果显示，蛋白NC2K约为28.5千道尔顿(kDa)。利用组氨酸亲和层析凝胶以及CM阴离子交换层析凝胶联用的方法，将蛋白NC2K进行分离纯化，最终获得纯度为90％以上的目的蛋白。泳道1：重组菌株诱导前样品，泳道2为诱导后表达6小时后的菌体样品，泳道3为表达菌裂解上清样品；泳道4为组氨酸亲和层析后获得的重组蛋白；泳道5为CM阴离子交换层析凝胶纯化的重组蛋白；泳道6为浓缩后的重组蛋白样品；M为低分子量蛋白标记。图2.蛋白NC2K促进原代皮肤成纤维细胞迁移用磷酸缓冲液将蛋白NC2K稀释，使其终浓度分别达到10微克/毫升和100微克/毫升(μg/ml)，以仅加入磷酸缓冲液的样品作为空白对照组，以100微克/毫升(μg/ml)神经细胞黏连蛋白(货号：AG265，sigma)为阳性对照组。然后将细胞置于37℃培养12小时，用原代细胞划痕实验进行检测。实验结果显示，A：空白对照组细胞间距为7.0毫米；B：10微克/毫升NC2K处理组的细胞间距为6.2毫米；C：100微克/毫升处理组的细胞间距为2.9毫米，D：100微克/毫升神经细胞黏连蛋白阳性对照组的细胞间距为6.5毫米，说明蛋白NC2K以剂量依赖的梯度方式促进原代皮肤成纤维细胞迁移，且在同等剂量下，NC2K的促进作用显著优于阳性对照。图3.蛋白NC2K不促进皮肤成纤维细胞增殖用磷酸缓冲液将蛋白NC2K稀释后，加入到96孔细胞培养板中，使其终浓度依次至40微克/毫升(μg/ml，低浓度)，200微克/毫升(中浓度)及1000微克/毫升(高浓度)，以加入磷酸缓冲液作为空白对照组。然后将细胞置于37℃培养48小时，用MTT方法进行检测。实验结果显示，蛋白NC2K对皮肤成纤维细胞没有促进增殖的效果，与空白对照组之间没有显著差异。图4.蛋白NC2K抑制细菌和真菌的增长将革兰氏阴性菌金黄色葡萄糖菌(Staphylococcusaureus)、革兰氏阳性菌枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)以及真菌白色念珠菌(Candidaalbicans)培养至对数生长期，用培养基稀释至OD本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID No.1所示，其中，自氮端起第2至7个氨基酸为组氨酸标签。/n

【技术特征摘要】
1.一种蛋白，其氨基酸序列如SEQIDNo.1所示，其中，自氮端起第2至7个氨基酸为组氨酸标签。


2.根据权利要求1所述的蛋白，其特征在于，所述组氨酸标签替换为FLAG标签和/或AVI标签。


3.一种编码如权利要求1或2所述的蛋白的核酸。


4.根据权利要求3所述的核酸，其特征在于，所述核酸的序列如SEQIDNo.2所示。


5.一种携带有如权利要求3或4所述的核酸且能表达如权利要求1或2所述蛋白的重组微生物。


6.根据权利要求5所述的重组微生物，其特征在于，所述重组微生物的出发菌株选自埃希氏菌属(Escherichia)和酿酒酵母属(Saccharomyce)中的至少一种。


7.根据权利要求6所述的重组微生物，其特征在于，所述重组微生物选自大肠杆菌(Escherichiacoli)、酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)和毕赤酵母(Pichiapastoris)中的至少一种。


8.一种组合物，其包括如权利要求1或2所述的...

【专利技术属性】
技术研发人员：苏志坚，李校堃，黄立伟，冯治国，冯娅，
申请(专利权)人：温州医科大学，
类型：发明
国别省市：浙江;33