一种人源化CYP2D6*1转基因小鼠的构建方法及其应用技术

技术编号：41395355 阅读：4 留言：0更新日期：2024-05-20 19:18

本发明专利技术涉及动物模型构建技术领域，尤其涉及一种人源化CYP2D6*1转基因小鼠的构建方法及其应用。本发明专利技术转基因小鼠的构建方法，包括如下步骤：(1)将人源化CYP2D6*1基因导入小鼠ES细胞中，得到重组ES细胞；(2)将Cas9‑gRNA载体转染至阳性克隆的重组ES细胞中，敲除小鼠Cyp2d基因簇，得到敲除基因片段的重组ES细胞；(3)将敲除基因片段后获得的阳性重组ES细胞进行扩增，扩增产物注射入小鼠的囊胚中，出生后的小鼠为嵌合体小鼠；(4)纯化所述的嵌合体小鼠得到纯合的人源化CYP2D6*1转基因小鼠。本发明专利技术构建得到的转基因小鼠接近人体基因，为药物代谢和内源物质代谢的研究提供依据。

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【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及动物模型构建，尤其涉及一种人源化cyp2d6*1转基因小鼠的构建方法及其应用。

技术介绍

1、cyp2d6是细胞色素p450(cytochrome p450，cyp450)超家族的成员，主要分布于肝脏内。参与临床25％常用药物及内源性物质部分神经递质、神经类固醇等的代谢。cyp2d6酶活性差异会引起药物的毒副作用差异。例如cyp2d活性降低可使降压药物美托洛尔代谢减慢，引起其血药浓度增加，严重可能导致低血压，心动过缓等副作用。

2、cyp2d6是人体cyp2ds基因中唯一有功能的基因，临床前药物研究小鼠是常用的研究工具，但是小鼠体内没有cyp2d6基因，其对应的功能同源基因是cyp2d22，小鼠体内部分同工酶的表达或功能尚未被表征。由此可知，消除鼠源背景引入人源cyp2d6的小鼠模型在一定程度上才能更好的模拟人体以cyp2d6为底物的内外源性物质的代谢过程。

3、构建人源cyp2d6*1转基因小鼠模型来开展药物研究，为发现潜在药物和药物之间的相互作用提供依据，具有广泛的应用前景和价值。但是现有技术并未发现人源cyp2d6*1转基因小鼠模型的构建方法。

4、基于此，提出本专利技术。

技术实现思路

1、本专利技术的目的在于提供了一种人源化cyp2d6*1转基因小鼠的构建方法及其应用。

2、为了实现上述专利技术目的，本专利技术提供以下技术方案：

3、本专利技术提供了一种人源化cyp2d6*1转基因小鼠的构建方法，包括如下步骤：

4、(1)将含有人源化cyp2d6*1基因的质粒导入小鼠es细胞中，得到重组es细胞；

5、(2)将cas9-grna载体转染至阳性克隆的重组es细胞中，敲除小鼠cyp2d基因簇，得到敲除基因片段的重组es细胞；

6、(3)将敲除基因片段后获得的阳性重组es细胞进行扩增，扩增产物注射入小鼠的囊胚中，出生后的小鼠为嵌合体小鼠；

7、(4)纯化所述的嵌合体小鼠得到纯合的人源化cyp2d6*1转基因小鼠。

8、作为优选，所述含有人源化cyp2d6*1基因的质粒由人源化cyp2d6*1打靶载体、u6promoter-sgrna1和u6 promoter-sgrna2构建得到；

9、所述人源化cyp2d6*1打靶载体的序列如seq id no:1所示；

10、所述人源化cyp2d6*1打靶载体包括5’同源臂、人源化cyp2d6promoter、人源化cyp2d6*1genomic dna-polya、pgk-neo-polya、3’同源臂和mc1-tk-polya。

11、作为优选，步骤(1)所述es细胞为jm8a3 es细胞；

12、步骤(1)所述小鼠为c57bl/6j小鼠；

13、步骤(1)所述导入的位置为小鼠的cyp2d22基因exon4～5之间。

14、作为优选，步骤(3)所述注射的方法为显微注射，

15、注射的受体小鼠为c57bl/6j小鼠。

16、本专利技术还提供了所述的构建方法构建得到的人源化cyp2d6*1转基因小鼠在制备研究药物代谢动力学模型中的应用。

17、作为优选，所述药物为美托洛尔。

18、本专利技术还提供了所述的构建方法构建得到的人源化cyp2d6*1转基因小鼠在在制备研究内源性脂质代谢模型中的应用。

19、本专利技术提供了一种人源化cyp2d6*1转基因小鼠的构建方法及其应用，按照本专利技术的方法构建得到的人源化cyp2d6*1转基因小鼠与野生型小鼠cyp2d基因活性存在差异，其在cyp2d6底物药物的代谢能力，以及血浆中脂质代谢方面也存在一定的差异，由于人源化cyp2d6小鼠基因型更接近于人类，因此构建cyp2d6*1小鼠模型有利于开展相关临床药物及药物相互作用研究，也有利于经其代谢的内源性物质代谢的研究，有望提供更高的参考价值。

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【技术保护点】

1.一种人源化CYP2D6*1转基因小鼠的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：

2.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述含有人源化CYP2D6*1基因的质粒由人源化CYP2D6*1打靶载体、U6 promoter-sgRNA1和U6 promoter-sgRNA2构建得到；

3.根据权利要求2所述的构建方法，其特征在于，步骤(1)所述ES细胞为JM8A3 ES细胞；

4.根据权利要求3所述的构建方法，其特征在于，步骤(3)所述注射的方法为显微注射，

5.权利要求1～4任意一项所述的构建方法构建得到的人源化CYP2D6*1转基因小鼠在制备研究药物代谢动力学模型中的应用。

6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述药物为美托洛尔。

7.权利要求1～4任意一项所述的构建方法构建得到的人源化CYP2D6*1转基因小鼠在制备研究内源性脂质代谢模型中的应用。

【技术特征摘要】

1.一种人源化cyp2d6*1转基因小鼠的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：

2.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述含有人源化cyp2d6*1基因的质粒由人源化cyp2d6*1打靶载体、u6 promoter-sgrna1和u6 promoter-sgrna2构建得到；

3.根据权利要求2所述的构建方法，其特征在于，步骤(1)所述es细胞为jm8a3 es细胞；

4.根...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈冰冰，钱建畅，胡国新，王雅慧，孔奇慧，
申请(专利权)人：温州医科大学，
类型：发明
国别省市：

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