具有强杀菌效果的杂合抗菌蛋白及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种具有强杀菌效果的杂合抗菌蛋白及其应用，所述的具有强杀菌效果的杂合抗菌蛋白，包括如SEQ ID NO 1所示的氨基酸序列，命名为AB469，以及由所述的AB469的催化域相似的序列组成的杂合蛋白、由所述的AB469的结合域相似的序列组成的杂合蛋白或由AB469的催化域和结合域位置互换组成的杂合蛋白。本发明专利技术的杂合抗菌蛋白，利用大肠杆菌或者酵母菌等进行表达，纯化后获得高纯度的杂合抗菌蛋白；该蛋白能快速裂解鲍曼不动杆菌、铜绿假单胞菌、肺炎克雷伯菌、沙门氏菌、大肠杆菌等革兰氏阴性菌。由该抗菌蛋白制成的抗菌制剂可用于预防和治疗细菌感染，可制成抗菌制剂用于预防和治疗细菌感染，以及医疗器械和医疗场所的杀菌等。

【技术实现步骤摘要】
具有强杀菌效果的杂合抗菌蛋白及其应用
本专利技术涉及杂合抗菌蛋白。技术背景抗生素已经广泛应用于医疗卫生、农业养殖领域，在治疗感染性疾病以及保障公共卫生安全中，发挥了重要作用。然而，随着抗生素大量使用，细菌对抗生素的耐药性问题日益严重，在世界范围内已经造成临床治疗上的困难及病死率增高，严重威胁人类健康。多重耐药菌主要包括鲍曼不动杆菌、铜绿假单胞菌、肠杆菌、肠球菌和金黄色葡萄球菌等，其中革兰氏阴性菌(G-菌)占比最大，尤其是鲍曼不动杆菌近几年耐药性越来越严重(MezzatestaML,D’AndreaMM,MigliavaccaR,etal.Epidemiologicalcharacterizationanddistributionofcarbapenem-resistantAcinetobacterbaumanniiclinicalisolatesinItaly[J].ClinicalMicrobiologyandInfection,2012,18(2):160-166.Durante-MangoniE,ZarrilliR.Globalspreadofdrug-resistantAcinetobacterbaumannii:molecularepidemiologyandmanagementofantimicrobialresistance[J].Futuremicrobiology,2011,6(4):407-422.)。世界卫生组织(WHO)列出12种重点耐药性细菌中，耐碳青霉烯类抗生素的鲍曼不动杆菌、铜绿假单胞菌、肠杆菌类最为严重，迫切需要开发新型抗菌药物，尤其是与传统抗生素作用模式不同的抗菌药物。传统抗生素具有广谱抗菌特点，对正常菌群也有同样作用。抗生素大量的使用过程中正常菌群也会产生耐药，耐药基因在正常菌群和致病菌之间相互传播，显著增加了耐药菌的产生的几率。肽聚糖是细菌细胞壁主要成分，是由糖链、肽链和肽键桥交联而成的三维网状结构，它维持着细胞壁的机械强度，保护细菌不受外部因素的影响。肽聚糖水解酶(peptidoglycanhydrolases)，是一类能特异性裂解细菌细胞壁肽聚糖的蛋白质(VollmerW,JorisB,CharlierP,etal.Bacterialpeptidoglycan(murein)hydrolases[J].FEMSmicrobiologyreviews,2008,32(2):259-286.)，主要包括噬菌体裂解酶、细菌素和细菌自溶酶等。比如金黄色葡萄球菌噬菌体裂解酶LysK、模仿葡萄球菌表达的细菌素溶葡萄球菌酶和肺炎链球菌自溶酶LytA。肽聚糖水解酶一般由两种结构域组成，即负责水解肽聚糖的催化结构域(催化域)和负责特异性靶向细菌细胞壁的结构域(结合域)。当肽聚糖水解酶加入到细菌溶液中，水解酶能特异性结合敏感菌并快速裂解其细胞壁。肽聚糖水解酶在体内、外的抗菌活性已经被大量证明(GerstmansH,Rodríguez-RubioL,LavigneR,etal.Fromendolysinstos:novelenzyme-basedapproachestokilldrug-resistantbacteria[J].BiochemicalSocietyTransactions,2016,44(1):123-128.GuoM,FengC,RenJ,etal.ANovelAntimicrobialEndolysin,LysPA26,againstPseudomonasaeruginosa[J].FrontiersinMicrobiology,2017,8.)。肽聚糖水解酶通过直接裂解细菌肽聚糖快速杀死特定细菌，抗菌谱窄，其杀菌机制与传统抗生素不同，能长期反复使用，不易诱导耐药性产生。在细菌的各个生长周期，肽聚糖水解酶都能直接将其裂解。窄谱的肽聚糖水解酶几乎不影响正常菌群。然而直接应用天然的肽聚糖水解酶会存在一些问题，如抗菌活性低、抗菌谱太窄、表达量低，溶解性差，催化域和结合域并不一定是最佳组合，或者两个结合域中间夹着其它非必要的结构域。野生型LysK含有2个催化域(CHAP和Amidase结构域)，其中Amidase结构域催化活性非常低，将其从LysK中去除后(LysKΔ221-390)并不影响蛋白的活性(BeckerSC,DongS,BakerJR,etal.LysKCHAPendopeptidasedomainisrequiredforlysisoflivestaphylococcalcells[J].FEMSmicrobiologyletters,2009,294(1):52-60.)。单独LysK的CHAP催化域在TSB培养基中也没有抗菌活性，在复杂环境下，催化域需要结合域的帮助才能起效，然而LysK自身的结合域效果不是最好的，存在亲和效率低和识别范围太小的问题。因此，构建高活性的杂合抗菌蛋白，对于促进新型抗菌药物的研发具有非常重要的意义，可以为细菌耐药性问题提供一种有效解决方法。2013年全球第一个抗菌蛋白产品Gladskin上市，用于完整皮肤的耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)引发的炎症性皮肤病，如湿疹、红斑痤疮和粉刺。目前还有多个抗菌蛋白已经进入临床研究，如Lysostaphin(中国，治疗创面金葡菌感染)、P128(印度，清除鼻腔粘膜金葡菌定植)、CF301(美国，治疗金葡菌引起的败血症)和SAL200(韩国，，治疗金葡菌引起的败血症)等；另外还有一些抗菌蛋白进入临床前研究，如Cpl-1、ClyS、ClyH和PlyV12等，分别治疗金葡菌、肺炎球菌和肠球菌引起的感染。进入临床的抗菌蛋白都集中在治疗G+菌感染，目前还没有治疗革兰氏阴性菌(G-菌)的抗菌蛋白进入临床研究。基于耐药G-菌严峻性和抗菌蛋白药物发展的不平衡，迫切需要研发针对G-菌的新型抗菌药物。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种具有强杀菌效果的杂合抗菌蛋白及其应用，以克服现有技术存在的缺陷，满足人们的需求。本专利技术所述的对革兰氏阴性菌强杀菌效果的杂合抗菌蛋白，包括如SEQIDNO1所示氨基酸序列，命名为AB469，以及由所述的AB469的催化域相似的序列组成的杂合蛋白、由所述的AB469的结合域相似的序列组成的杂合蛋白或由AB469的催化域和结合域位置互换组成的杂合蛋白；所述的AB469含有285个氨基酸，分子量31.8kD，理论等电点9.8，经过2步纯化后纯度能够达到95％以上，SDS-PAGE电泳显示AB469的分子量在32kD左右；编码所述的AB469的核酸序列如SEQIDNO:2，命名为ab469；试验证明，所述的AB469具有较高的溶解性和稳定性；体外试验证明，所述的AB469具有高活性和广谱性，对鲍曼不动杆菌、铜绿假单胞菌、肺炎克雷伯、伤寒沙门氏菌和大肠杆菌都有很好的杀菌效果。10μg/mLAB469作用2h能使得鲍曼不动杆菌(ATCC19606)、铜绿假单胞菌(ATCC15442)和伤寒沙门氏菌(CMCC50094)下降大于7个Lo本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.具有强杀菌效果的杂合抗菌蛋白，其特征在于，包括氨基酸序列如SEQ ID NO 1所示，命名为AB469，以及由所述的AB469的催化域相似的序列组成的杂合蛋白、由所述的AB469的结合域相似的序列组成的杂合蛋白或由AB469的催化域和结合域位置互换组成的杂合蛋白。/n

【技术特征摘要】
1.具有强杀菌效果的杂合抗菌蛋白，其特征在于，包括氨基酸序列如SEQIDNO1所示，命名为AB469，以及由所述的AB469的催化域相似的序列组成的杂合蛋白、由所述的AB469的结合域相似的序列组成的杂合蛋白或由AB469的催化域和结合域位置互换组成的杂合蛋白。


2.编码所述的AB469的核酸序列如SEQIDNO:2，命名为ab469。


3.根据权利要求1所述的具有强杀菌效果的杂合抗菌蛋白，其特征在于，由所述的AB469的催化域相似的序列组成的杂合蛋白，如SEQIDNO3，命名为AB46M9。


4.编码权利要求3所述的AB46M9的核酸序列如SEQIDNO:4，命名为ab46m9。


5.根据权利要求1所述的具有强杀菌效果的杂合抗菌蛋白，其特征在于，由...

【专利技术属性】
技术研发人员：陆海荣，黄青山，李国栋，黄晋江，赵晓蔚，陆婉英，
申请(专利权)人：江西缘生生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：江西;36