液-液相分离驱动的基于蛋白质的水下粘合涂层制造技术

液‑液相分离(LLPS)驱动的基于蛋白质的水下粘合涂层是由包含海洋粘合蛋白质(MAP)结构域和液‑液相分离介导的低复杂度(LC)结构域的二聚蛋白质制成。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】液-液相分离驱动的基于蛋白质的水下粘合涂层引言可以通过蛋白质中的低复杂度(LC)结构域促进的液-液相分离(LLPS)与医学意义在生理学上高度相关；例如，影响蛋白质的LLPS能力的突变可以驱动神经退行性疾病如肌萎缩性侧索硬化症(ALS)和泛素阳性额颞叶变性(FTLD-U)的发病机制。我们的研究小组探索被像贻贝、藤壶和沙堡蠕虫那样的海洋生物使用的锚定斑块启发的生物启发的水下粘合剂。寻求开发超强的水下粘合涂层，并从已知的增加润湿的生物物理过程中汲取灵感，我们探索了使用LLPS以改善作为水下粘合剂的含有LC结构域蛋白质的润湿性质和自组装。我们证明LLPS驱动的机制促进润湿、吸附、底涂和在各种基底包括像特氟龙那样具有挑战性的材料和像微流体装置内表面那样难以接近的位置上的致密且均匀的淀粉状蛋白纳米纤维涂层的形成。此外，涂层可以在宽的pH值范围容易地沉积在基底上。我们的LLPS驱动的涂层具有的水下粘合能远大于曾经报道的最强的基于蛋白质的水下粘合剂。专利技术概述本专利技术提供用于制备液-液相分离(LLPS)驱动的基于蛋白质的水下粘合涂层的方法和组合物。在一个方面，本专利技术提供一种二聚蛋白质，其包含海洋粘合蛋白质(adhesiveprotein)(MAP)结构域和液-液相分离(LLPS)介导的低复杂度(LC)结构域。在实施方案中：-结构域在融合蛋白质中连接；-结构域通过结构域上的亲和标签连接；-海洋粘合蛋白质(MAP)包含选自以下的多肽：a)贻贝足蛋白质(mfp5、mfp3、mfp3s)；b)藤壶蛋白质(cp19k、cp20k和cp68k藤壶表面粘合蛋白质)；和c)沙堡蠕虫粘合蛋白质(Pc2和Pc3)；-低复杂度(LC)结构域包含选自以下的多肽：LC结构域TARDNA结合蛋白质43(TDP-43)(263-414)；融合在肉瘤中的RNA结合蛋白质(FUS)(2-214)；异质核内核糖核蛋白质A1(hnRNPA1)(186-320)；异质核内核糖核蛋白质A2(hnRNPA2)(181-341)；细胞毒性颗粒相关的RNA结合蛋白质TIA1(280-375)；细胞质聚腺苷酸化元件结合蛋白质2(CPEB2)(2-137)；脆性X智力低下蛋白质(FMRP)(466-632)；冷诱导RNA结合蛋白质(CIRBP)(1-172)；RNA结合基序(RNP1，RRM)蛋白质3(RBM3)(1-157)；和酵母Sup35(2-134)；和/或-二聚蛋白质选自特定的实例，包括：GFP-FUSLC-mfp5、mfp5-FUSLC、mfp3-TDP-43LC、mCherry-FUSLC-mfp3和Spytag-FUSLC:mfp5-spycatcher。一方面，本专利技术提供淀粉状蛋白纳米纤维涂层，其包含主题二聚蛋白质，特别是在水下，并且特别是其中在基底上微图案化所述涂层。在实施方案中，所述涂层提供的水下粘合能是相应的MAP涂层的至少两倍，通常为2-3倍，通常大于30或40mJm-2，例如为30-50或40-50mJm-2。一方面，本专利技术提供一种包含主题涂层的基底。在实施方案中，所述基底选自金属、聚合物和无机基底，柔性和内部基底表面，例如微流体通道和微管。一方面，本专利技术提供一种在基底上制备淀粉状蛋白纳米纤维涂层的方法，所述方法包括：在其中在基底上形成包含二聚蛋白质的LLPS诱导的淀粉状蛋白纳米纤维涂层的条件下孵育主题二聚蛋白质。在实施方案中：-所述方法在pH3-11的pH条件下操作或可操作。-所述基底选自金属、聚合物和无机基底，柔性和内部基底表面，例如微流体通道和微管。-所述涂层例如通过掩模辅助的图案化或软光刻(例如微转移模塑或复制模塑)在基底上被微图案化。本专利技术包括所列举的特定实施方案的所有组合，就好像每个组合已经被费力地列举一样。附图简述图1A-D.用于工程液-液相分离诱导的自组装水下粘合剂的组合和模块化蛋白质结构域策略。(A)在海洋贻贝的粘合斑块中起作用的粘合蛋白质mfp5的示意图。Mfp5是富含赖氨酸和多巴(Dopa)残基的贻贝粘合足蛋白质，在溶液中显示出无规卷曲结构，并且对于贻贝的界面水下粘合是必要的。(B)人类TARDNA结合蛋白质43(TDP-43)与特定RNA一起形成介导神经元细胞中的细胞过程的TDP-43核糖核蛋白质(RNP)颗粒的示意图。TDP-43既包含RNA识别基序，又包含低复杂度结构域，该结构域是富含甘氨酸和有助于RNP颗粒的自组装的不带电荷的极性氨基酸残基的内在无序的结构域，所述RNP颗粒的自组装由称为液-液相分离(LLPS)的过程驱动。(C)通过合理地融合编码A和B中所示的蛋白质结构域的序列以形成His标记的mfp5-TDP-43LC(“MTLC”)融合蛋白质，实现粘合蛋白质的模块化遗传设计。(D)溶液中的MTLC融合蛋白质单体可以组装成由LLPS驱动的凝结的液体状液滴(左)。液体状液滴倾向于散布并吸附在表面上，促进MTLC涂层的底涂过程(中左)。液体状液滴在基底表面附近局部富集，并且这些液滴具有高浓度的蛋白质单体，因此促进基底上原纤维的形成(中右)。然后，另外的单体可以聚集在这些表面定位的原纤维上，最终在表面上形成淀粉状蛋白纳米纤维涂层。由于它们的高表面积和暴露在淀粉状蛋白核心外部的纳米纤维表面的MTLCmfp5结构域的粘合性质，MTLC纳米纤维涂层表现出强大的水下粘合。图2A-G.LLPS诱导的MTLC粘合涂层的形态和结构表征。(A)通过在4℃和25℃下孵育MTLC单体溶液并用刚果红对相应样品进行染色(较下左)制成的粘合涂层的照片(顶部左)。两个样品的mfp5-TDP-43LC纳米纤维的X射线纤维衍射图(右)显示了淀粉状蛋白纳米纤维的交叉β脊的典型衍射图，其中子午反射(d2)为约(对应于原纤维中每层β-片内β-链之间的间距)和赤道反射(d1)为约(对应于原纤维中每层β-片之间的片间堆积距离)。(B)在4℃下形成的MTLC涂层的分层结构的形态表征。MTLC涂层是由纳米纤维束形成的致密纳米纤维网(TEM图像，左)，所述纳米纤维束通过淀粉状蛋白纳米纤维的横向堆叠组装而成(TEM图像，中)。这些纳米纤维的直径为约3纳米(AFM图像，右)。(C)在4℃和25℃孵育的溶液中MTLC的ThT荧光曲线。ThT荧光测定用于监测和量化淀粉状蛋白纳米纤维形成的动力学。(D)在4℃和25℃下孵育的溶液中MTLC的浊度-时间曲线；在OD600下测量。(E)在不同时间间隔拍摄的在4℃和25℃下孵育的MTLC溶液的照片。(F)孵育1小时、3小时和12小时后，评估在4℃和25℃下吸附在玻璃表面的MTLC蛋白质单体的相分离诱导的组装的微分干涉相差(DIC)显微图像。在最初的6小时内，LLPS驱动液体状液滴的形成，随后在液体状液滴附近出现原纤维。然后MTLC单体聚集在原纤维上，最终产生致密的MTLC纳米纤维涂层。(G)QCM-D实验中的频率变化比较显示在4℃和2本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种二聚蛋白质，其包含海洋粘合蛋白质(MAP)结构域和液-液相分离(LLPS)介导的低复杂度(LC)结构域。/n

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】20180818 CN PCT/CN2018/1012191.一种二聚蛋白质，其包含海洋粘合蛋白质(MAP)结构域和液-液相分离(LLPS)介导的低复杂度(LC)结构域。


2.权利要求1所述的二聚蛋白质，其中，所述结构域在融合蛋白质中连接。


3.权利要求1所述的二聚蛋白质，其中，所述结构域通过结构域上的亲和标签连接。


4.权利要求1、2或3所述的二聚蛋白质，其中，所述海洋粘合蛋白质(MAP)包含选自以下的多肽：
a)贻贝足蛋白质(mfp5、mfp3、mfp3s)；
b)藤壶蛋白质(cp19k、cp20k和cp68k藤壶表面粘合蛋白质)；和
c)沙堡蠕虫粘合蛋白质(Pc2和Pc3)。


5.权利要求1、2、3或4所述的二聚蛋白质，其中，所述低复杂度(LC)结构域包含选自以下的多肽：
LC结构域TARDNA结合蛋白质43(TDP-43)(263-414)；
融合在肉瘤中的RNA结合蛋白质(FUS)(2-214)；
异质核内核糖核蛋白质A1(hnRNPA1)(186-320)；
异质核内核糖核蛋白质A2(hnRNPA2)(181-341)；
细胞毒性颗粒相关的RNA结合蛋白质TIA1(280-375)；
细胞质聚腺苷酸化元件结合蛋白质2(CPEB2)(2-137)；
脆性X智力低下蛋白质(FMRP)(466-632)；
冷诱导RNA结合蛋白质(CIRBP)(1-172)；
RNA结合基序(RNP1，RRM)蛋白质3(RBM3)(1-157)；和
酵母Sup35(...

【专利技术属性】
技术研发人员：钟超，崔孟奎，
申请(专利权)人：上海科技大学，
类型：发明
国别省市：上海;31