结合Gα蛋白的单域抗体制造技术

本发明专利技术涉及结合Gα蛋白的单域抗体(sdAb)，所述单域抗体包含由具有下式(I)的3个CDR区(CDR1至CDR3)和4个铰链区(FR1至FR4)组成的氨基酸序列：FR1‑CDR1‑FR2‑CDR2‑FR3‑CDR3‑FR4(I)，并且有利地具有小于100nM的解离常数(Kd)(用FRET测量)。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】结合Gα蛋白的单域抗体
本专利技术涉及抗体领域，尤其涉及结合Gα蛋白的单域抗体(sdAb)领域。根据本专利技术的sdAb特别适用于在FRET中使用，例如以与能够对其进行检测的分子偶联的重链抗体(HcAb)的形式。
技术介绍
“G蛋白偶联受体”或“GPCR”是哺乳动物中最具代表性的膜受体。它们是与各种生理过程(例如视觉，嗅觉，多种神经肽、激素的作用的介导等)相关的多种多样细胞反应的开端。它们可被性质非常多样的配体(例如，如光子、离子、嗅觉分子、味觉分子、氨基酸、核酸、脂质、外源性分子(例如大麻素类)、趋化因子或激素)激活。这些受体具有七个处于α-螺旋形式的跨膜区域，各自包含22至24个氨基酸。在人中，GPCR可分为5个主要家族，称为视紫红质、黏附、分泌素、谷氨酸、Frizzled/Taste2(Fredriksson等，2003)。相对于基础构象状态，GPCR根据配体激活水平来改变其功能构象状态。当通过特异性配体的结合激活GPCR时，激动剂-受体复合物构象的改变使得异源三聚体G蛋白得以激活。G蛋白是异源三聚体蛋白，其通过启动生化反应级联来转导来自GPCR的激活信号，其目的是将信号从细胞外部转导至细胞内部。G蛋白位于质膜的内表面，由三个亚基(α、β、γ)形成。α亚基能够结合鸟嘌呤核苷酸，GDP或GTP。所述的GPCR和G蛋白的一般作用机理示于图1中，并总结如下：-在其非活化的静止状态中，G蛋白的α亚基与GDP核苷酸结合(与GDP结合的全G蛋白(fullGprotein))；-GPCR活化后，GPCR与G蛋白的α亚基结合并触发G蛋白的激活过程，包括两个步骤：1)GDP从G蛋白释放产生空G蛋白(emptyGprotein)，并形成非活化的GPCR/空G蛋白复合体；以及2)GTP附着，从而导致形成活化的G蛋白(呈GTP形式，与GTP结合的全G蛋白)。在第一步中，与受体结合的G蛋白处于所谓的“空形式”。该状态在文献中被描述为暂时的，因为据描述GTP核苷酸迅速结合至G蛋白的α亚基。另外，活化的G蛋白的β/γ亚基与α亚基解离。-与GTP结合的全G蛋白的α亚基随后结合至效应物以激活它们。效应物转而激活信号传导通路，从而引起细胞反应。-然后，GTP被G蛋白的α亚基水解为GDP，并且该α亚基与β/γ亚基重新结合，以重新形成与GDP结合的全G蛋白(非活化状态)。至少有17种不同的α亚基：Gαi1、Gαi2、Gαi3、Gαo1、Gαo2、Gαq、Gα12、Gα13、Gαs、Gαz、Gαt1、Gαt2、Gα11、Gα14、Gα15、Gα16或Gαgus。考虑到GPCR参与许多信号传导通路，现有技术中已经开发了用于研究其活性的工具，其目的通常是为这些具有潜在治疗活性的受体鉴别新的配体。以这些工具为例，可以提及使用GTP的不可水解或缓慢水解的放射性衍生物，特别是GTP-γ-S，其在受体被激活时结合至Gα蛋白。也有基于酶活性测定的重组系统(例如荧光素酶)，其表达受受体活化产生的第二信使控制。还合成了抗体来检测GPCR在细胞表面水平的激活(DamienMaurel.OligomérisationdesrécepteurscouplésauxprotéinesG:deuxouplus？ApplicationdestechnologiesdeFRETentempsrésoluaucasdurécepteurGABAB.Biologiecellulaire.UniversitéMontpellierI,2006，法国)。还可以参考专利EP2723764B1，该专利提出了纳米抗体，该纳米抗体结合至Gα蛋白和Gβ/γ蛋白之间的界面，从而使得能够稳定GPCR/G蛋白复合体。然而，没有一种现有技术的工具能够特异性地检测G蛋白的α亚基，更不用说结合Gα蛋白的sdAb，特别是在FRET中使用的sdAb。因此，本专利技术有利地提出了单域抗体(sdAb)，例如结合Gα蛋白(Gα蛋白)的重链抗体(HcAb)。
技术实现思路
本专利技术涉及结合Gα蛋白的单域抗体(sdAb)。本专利技术的第一主题涉及结合Gα蛋白的单域抗体(sdAb)，所述单域抗体包含由按照下式(I)的3个CDR区(CDR1至CDR3)和4个铰链区(FR1至FR4)组成的氨基酸序列：FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4(I)所述抗体关于全Gα蛋白具有小于100nM的解离常数(Kd)(在FRET中测量)。本专利技术的第二主题涉及结合Gα蛋白的单域抗体(sdAb)，所述单域抗体包含由按照下式(I)的3个CDR区(CDR1至CDR3)和4个铰链区(FR1至FR4)组成的氨基酸序列：FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4(I)其中：-CDR1与选自如下序列的氨基酸序列具有至少80％的同源性：SEQIDNO：1、SEQIDNO：9、SEQIDNO：17、SEQIDNO：25、SEQIDNO：33、SEQIDNO：41、SEQIDNO：49、SEQIDNO：57和SEQIDNO：65；-CDR2与选自如下序列的氨基酸序列具有至少80％的同源性：SEQIDNO：2、SEQIDNO：10、SEQIDNO：18、SEQIDNO：26、SEQIDNO：34、SEQIDNO：42、SEQIDNO：50、SEQIDNO：58和SEQIDNO：66；以及-CDR3与选自如下序列的氨基酸序列具有至少80％的同源性：SEQIDNO：3、SEQIDNO：11、SEQIDNO：19、SEQIDNO：27、SEQIDNO：35、SEQIDNO：43、SEQIDNO：51、SEQIDNO：59和SEQIDNO：67。本专利技术的第三主题涉及编码根据本专利技术的单域抗体(sdAb)的核酸序列。本专利技术的第四主题涉及包含根据本专利技术的核酸序列的重组载体。本专利技术的第五主题涉及包含根据本专利技术的载体或根据本专利技术的核酸序列的细胞。除非另有说明，术语“根据本专利技术的抗体”、“本专利技术的抗体”、“根据本专利技术的sdAb”或“本专利技术的sdAb”既指本专利技术的第一主题，又指本专利技术的第二主题。下面更精确地描述本专利技术的主题。附图说明图1：代表了GPCR的激活机制和Gα蛋白激活的不同阶段，即非活化形式(与GDP结合的Gα蛋白)和活化形式(与GTP结合的Gα蛋白)。图2：图3-图11中实施的用于确定重链可变结构域(VH)的亲和力(Kd)的HTRF(TR-FRET)测定原理。图3：通过TR-FRET测定确定VHF9的亲和力(Kd)。使用图2中详述的测定原理。Gαi1蛋白负载有过量的GTPgS(10μM)。对于VHF9/Gαi1蛋白相互作用，得到Kd为32nM。图4：通过TR-FRET测定确定VHF11的亲和力(Kd)。使用图2中详述的测定原理。Gαi1蛋白负载有过量的GTPgS(10μM)。对于VHF11/Gαi1蛋白相互作用，得到Kd为3nM。本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种单域抗体(sdAb)，所述单域抗体结合Gα蛋白，所述单域抗体包含由按照下式(I)的3个CDR区(CDR1至CDR3)和4个铰链区(FR1至FR4)组成的氨基酸序列：/nFR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4 (I)/n关于全Gα蛋白，所述抗体具有小于100nM的解离常数(Kd)，所述解离常数在FRET中测量。/n

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】20180727 FR 18570261.一种单域抗体(sdAb)，所述单域抗体结合Gα蛋白，所述单域抗体包含由按照下式(I)的3个CDR区(CDR1至CDR3)和4个铰链区(FR1至FR4)组成的氨基酸序列：
FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4(I)
关于全Gα蛋白，所述抗体具有小于100nM的解离常数(Kd)，所述解离常数在FRET中测量。


2.如权利要求1所述的抗体，其中：
-CDR1与选自如下序列的氨基酸序列具有至少80％的同源性：SEQIDNO：1、SEQIDNO：9、SEQIDNO：17、SEQIDNO：25、SEQIDNO：33、SEQIDNO：41、SEQIDNO：49、SEQIDNO：57和SEQIDNO：65；
-CDR2与选自如下序列的氨基酸序列具有至少80％的同源性：SEQIDNO：2、SEQIDNO：10、SEQIDNO：18、SEQIDNO：26、SEQIDNO：34、SEQIDNO：42、SEQIDNO：50、SEQIDNO：58和SEQIDNO：66；以及
-CDR3与选自如下序列的氨基酸序列具有至少80％的同源性：SEQIDNO：3、SEQIDNO：11、SEQIDNO：19、SEQIDNO：27、SEQIDNO：35、SEQIDNO：43、SEQIDNO：51、SEQIDNO：59和SEQIDNO：67。


3.一种单域抗体(sdAb)，所述单域抗体结合Gα蛋白，所述单域抗体包含由按照下式(I)的3个CDR区(CDR1至CDR3)和4个铰链区(FR1至FR4)组成的氨基酸序列：
FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4(I)
其中：
-CDR1与选自如下序列的氨基酸序列具有至少80％的同源性：SEQIDNO：1、SEQIDNO：9、SEQIDNO：17、SEQIDNO：25、SEQIDNO：33、SEQIDNO：41、SEQIDNO：49、SEQIDNO：57和SEQIDNO：65；
-CDR2与选自如下序列的氨基酸序列具有至少80％的同源性：SEQIDNO：2、SEQIDNO：10、SEQIDNO：18、SEQIDNO：26、SEQIDNO：34、SEQIDNO：42、SEQIDNO：50、SEQIDNO：58和SEQIDNO：66；以及
-CDR3与选自如下序列的氨基酸序列具有至少80％的同源性：SEQIDNO：3、SEQIDNO：11、SEQIDNO：19、SEQIDNO：27、SEQIDNO：35、SEQIDNO：43、SEQIDNO：51、SEQIDNO：59和SEQIDNO：67。


4.如权利要求1-3中任一项所述的抗体，其中：
-CDR1与SEQIDNO：1具有至少80％的同源性，CDR2与SEQIDNO：2具有至少80％的同源性，并且CDR3与SEQIDNO：3具有至少80％的同源性；
-CDR1与SEQIDNO：9具有至少80％的同源性，CDR2与SEQIDNO：10具有至少80％的同源性，并且CDR3与SEQIDNO：11具有至少80％的同源性；
-CDR1与SEQIDNO：17具有至少80％的同源性，CDR2与SEQIDNO：18具有至少80％的同源性，并且CDR3与SEQIDNO：19具有至少80％的同源性；
-CDR1与SEQIDNO：25具有至少80％的同源性，CDR2与SEQIDNO：26具有至少80％的同源性，并且CDR3与SEQIDNO：27具有至少80％的同源性；
-CDR1与SEQIDNO：33具有至少80％的同源性，CDR2与SEQIDNO：34具有至少80％的同源性，并且CDR3与SEQIDNO：35具有至少80％的同源性；
-CDR1与SEQIDNO：41具有至少80％的同源性，CDR2与SEQIDNO：42具有至少80％的同源性，并且CDR3与SEQIDNO：43具有至少80％的同源性；
-CDR1与SEQIDNO：49具有至少80％的同源性，CDR2与SEQIDNO：50具有至少80％的同源性，并且CDR3与SEQIDNO：51具有至少80％的同源性；
-CDR1与SEQIDNO：57具有至少80％的同源性，CDR2与SEQIDNO：58具有至少80％的同源性，并且CDR3与SEQIDNO：59具有至少80％的同源性；或者
-CDR1与SEQIDNO：65具有至少80％的同源性，CDR2与SEQIDNO：66具有至少80％的同源性，并且CDR3与SEQIDNO：67具有至少80％的同源性。


5.如权利要求1-4中任一项所述的抗体，其中：
-FR1与选自如下序列的氨基酸序列具...

【专利技术属性】
技术研发人员：托马斯·法比安·米歇尔·鲁，埃洛迪·朱莉·迪皮伊，埃里克·雅克·克里斯蒂安·特林凯，梅兰妮·达·席尔瓦，卡米尔·S·麦哈克，帕特里克·JM·查姆斯，丹尼尔·巴蒂，朱莉安·珍马吕斯·苏尔，菲利普·龙达，珍菲利普·R·珀，
申请(专利权)人：CISBIO生物试验公司，法国国家科学研究中心，国家健康与医学研究院，
类型：发明
国别省市：法国;FR