用于测量对G蛋白偶联受体活性的调控的方法技术

本发明专利技术涉及对分子调控G蛋白偶联受体(GPCR)的活性的能力进行测定的方法，所述方法包括以下步骤：a)将以下物质引入第一容器：‑携带一种或多种GPCR以及一种或多种G蛋白的第一膜制剂，‑GDP源或GTP源，‑用RET伴侣对的第一成员标记的G蛋白α亚基(Gα蛋白)的第一配体以及用RET伴侣对的第二成员标记的Gα蛋白的第二配体，所述配体能够单独地或组合地特异性结合空Gα蛋白或全Gα蛋白；b)对所述第一容器中发射的RET信号进行测量；c)(i)将待测试的分子以及与步骤a)中相同的反应物引入第二容器中，或者(ii)将待测试的分子引入所述第一容器中；d)对在步骤c)中获得的第一容器中或第二容器中发射的RET信号进行测量；e)对步骤b)和步骤d)中获得的信号进行比较。

A method for measuring the regulation of G protein coupled receptor activity

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】用于测量对G蛋白偶联受体活性的调控的方法
本专利技术涉及用于测量G蛋白偶联受体(GPCR)活化的调控的新方法，例如用于对分子调控GPCR活化的能力进行测定的方法。根据本专利技术的方法使得能够检测GPCR制剂中空G蛋白(emptyGprotein)或全G蛋白(fullGprotein)的出现或消失。
技术介绍
G蛋白偶联受体(GPCR)是哺乳动物以及整个动物界的膜受体家族。G蛋白是由GPCR激活的异三聚体蛋白(3个亚基：α、β和γ)。通过GPCR，G蛋白在将信号从细胞外转导至细胞内(即，对外部刺激的细胞反应)中发挥作用。通常描述的它们的作用机理如图1所示，并总结如下：-在其未活化状态(静息状态)中，G蛋白的α亚基与核苷酸GDP结合(与GDP结合的全G蛋白)；-GPCR活化后，GPCR结合至G蛋白的α亚基并触发G蛋白激活过程，该过程由两个步骤构成：1)GDP离开G蛋白以产生空G蛋白，并形成未活化GPCR/空G蛋白复合体；以及2)结合GTP，从而使得活化的G蛋白(处于GTP形式，与GTP结合的全G蛋白)形成。在第一步中，与受体结合的G蛋白处于称为“空形式”的形式。因为据描述核苷酸GTP快速结合至G蛋白的α亚基，该状态在文献中被描述为暂时的。此外，活化的G蛋白的β/γ亚基与α亚基解离；-然后，与GTP结合的全G蛋白的α亚基结合至效应物以将它们激活。效应物转而激活引起细胞反应的信号传导通路；-然后，GTP被G蛋白α亚基水解为GDP，而α亚基与β/γ亚基重新结合以重新形成与GDP结合的全G蛋白(未活化状态)。存在对于不同的效应物具有不同的选择性谱并由此诱导优先的信号传导通路活化的数种Gα蛋白亚型。GPCR与许多重要的生理功能相关，并且被认为是多种疾病的优选治疗靶标之一。因此，开发出了许多体外筛选测试来鉴别能够调控GPCR的分子。开发出的测试利用了G蛋白激活的不同机制并实施了多种技术(Zhang等；ToolsforGPCRdrugdiscovery；(2012)ActaPharmacologicaSinica)。可特别提及使用放射性标记的配体对配体与GPCR的亲和力进行测量的亲和力测试，使用与GPCR附着的闪烁显像珠的邻近闪烁显像测试(proximityscintigraphytests)或使用可缓慢水解或不可水解的GTP(例如GTPγS)的功能测试。然而，这些测试难以实施，并且有时需要可能限制其作为高通量筛选(HTS)分析这一用途的膜过滤步骤。已开发出其它分析以证明GPCR活化。这些测试尤其基于共振能量转移(RET)技术，例如荧光共振能量转移(FRET)或生物发光共振能量转移(BRET)。实例包括通过使用以下物质来突出GPCR与G蛋白之间的相互作用的能量转移技术：融合至GPCR的供体与融合至G蛋白的接受体(WO2006/086883和WO2003/008435)，或者融合至G蛋白α亚基的接受体与融合至G蛋白β亚基和/或γ亚基的供体(Bunemann等，Proc.Natl.Acad.Sci.，2003，26，16077-16082)。然而，由于这些技术需要融合蛋白的制备并且不允许进行细胞内源表达的GPCR和G蛋白(即，未修饰且未过度表达)的研究，因此这些技术有局限。另一方面，为了区分可被受体激活的Gα蛋白的不同亚型，这些技术需要制备多种膜样品(针对Gα蛋白的每种亚型的特定制剂)。能量转移技术也已用于开发测试以使G蛋白的GTP(活化)形式或G蛋白的GDP(未活化)形式的调控可视化。一个实例是使用以下形式：具有融合至生物素标记的G蛋白，从而结合与链霉亲和素蛋白偶联的供体以及与不可水解或可缓慢水解的GTP类似物结合的接受体(WO2006/035208)。另一方面，另一种形式使用区分GTP形式和GDP形式并通过链霉亲和素蛋白(所述链霉亲和素蛋白与供体偶联)结合至供体的生物素化肽(KaroBio)。使用抗6HIS抗体，将接受体与融合有6HIS标签的GPCR结合(WO2004/035614)。因为这些技术还需要制备融合蛋白并且不允许进行细胞内源表达的G蛋白和GPCR的研究，它们也是有局限的。同样，为了区分可被受体激活的Gα蛋白的不同亚型，这些技术需要制备多种膜样品。最后，最近的能量转移形式使用上述生物素化肽(KaroBio)与偶联至供体的链霉亲和素以及结合至接受体的GTPγS类似物(Frang等，https：//shop.perkinelmer.com/Content/relatedmaterials/posters/sps_006943gtplance.pdf.)。然而，这种最近的形式不能将非关联的G蛋白(与GDP或GTP核苷酸结合的G蛋白)与当其被化合物激活时与GPCR关联的形式(空G蛋白)区分开。因此，真正需要灵敏且可靠的方法，以容易地测定GPCR活化的调控，例如容易地测定分子调控GPCR活化的能力，和/或测定哪种G蛋白亚型被GPCR激活。
技术实现思路
本专利技术旨在提出用于体外筛选能够调控GPCR的分子的新方法。此新方法特别基于区分G蛋白的全形式(与GTP结合的全G蛋白或与GDP结合的全G蛋白)与G蛋白的空形式的能力，就本专利技术人所知，从未使用过该方法来对GPCR的活化进行测量。具体而言，本专利技术具有以下优点：1)使用基于荧光的检测方法，因此为非放射性的；2)不需要任何洗涤步骤，从而简化了其实施，特别是用于筛选高通量化合物的活性；3)尤其允许对未修饰的G蛋白和GPCR蛋白的研究；4)允许在含有不同亚型的同一膜制剂中对由GPCR激活的Gα蛋白的这些不同亚型进行区分(通过使用区分Gα蛋白亚型的检测配体来提供所述区分)。根据第一方面，本专利技术涉及对分子调控G蛋白偶联受体(GPCR)的活化的能力进行测定的方法，所述方法包括以下步骤：a)将以下物质引入第一容器：-携带一种或多种GPCR以及一种或多种G蛋白的膜制剂，-GDP源或GTP源，-用RET伴侣对的第一成员标记的G蛋白α亚基(Gα蛋白)的第一配体，以及用RET伴侣对的第二成员标记的Gα蛋白的第二配体，所述配体能够单独地或组合地特异性结合空Gα蛋白或全Gα蛋白；b)对所述第一容器中发射的RET信号进行测量；c)(i)将测试分子以及与步骤a)中相同的试剂引入第二容器中，或者(ii)将测试分子引入所述第一容器中；d)对步骤c)中获得的第一容器或第二容器中发射的RET信号进行测量；e)对步骤b)和步骤d)中获得的信号进行比较；-当使用能够特异性结合空Gα蛋白的配体以及GDP源时，信号增加表明所述分子为GPCR激动剂；-当使用能够特异性结合空Gα蛋白的配体以及GDP源时，信号降低表明所述分子为GPCR反向激动剂；-当使用能够特异性结合全Gα蛋白的配体以及GDP源时，信号降低表明所述分子为GPCR激动剂；-当使用能够特异性结合全Gα蛋白的配体以及GDP源时，信号增加表明所述分子为GPCR反向激动剂；-当使用能够特异性结合空G本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种对分子调控G蛋白偶联受体(GPCR)的活化的能力进行测定的方法，所述方法包括以下步骤：/na)将以下物质引入第一容器：/n-携带一种或多种GPCR以及一种或多种G蛋白的膜制剂，/n-GDP源或GTP源，/n-用RET伴侣对的第一成员标记的G蛋白α亚基(Gα蛋白)的第一配体以及用RET伴侣对的第二成员标记的Gα蛋白的第二配体，所述配体能够单独地或组合地特异性结合空Gα蛋白或全Gα蛋白；/nb)测量所述第一容器中发射的RET信号；/nc)(i)将测试分子以及与步骤a)中相同的试剂引入第二容器中，或者(ii)将所述测试分子引入所述第一容器中；/nd)测量在步骤c)中获得的所述第一容器中或所述第二容器中发射的RET信号；/ne)比较在步骤b)和步骤d)中获得的信号；/n-当使用能够特异性结合空Gα蛋白的配体以及GDP源时，信号增加表明所述分子为GPCR激动剂；/n-当使用能够特异性结合空Gα蛋白的配体以及GDP源时，信号降低表明所述分子为GPCR反向激动剂；/n-当使用能够特异性结合全Gα蛋白的配体以及GDP源时，信号降低表明所述分子为GPCR激动剂；/n-当使用能够特异性结合全Gα蛋白的配体以及GDP源时，信号增加表明所述分子为GPCR反向激动剂；/n-当使用能够特异性结合空Gα蛋白的配体以及GTP源时，信号增加表明所述分子为GPCR激动剂；/n-当使用能够特异性结合空Gα蛋白的配体以及GTP源时，信号降低表明所述分子为GPCR反向激动剂；/n-当使用能够特异性结合全Gα蛋白的配体以及GTP源时，信号降低表明所述分子为GPCR激动剂；/n-当使用能够特异性结合全Gα蛋白的配体以及GTP源时，信号增加表明所述分子为GPCR反向激动剂。/n...

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】20170728 FR 17572631.一种对分子调控G蛋白偶联受体(GPCR)的活化的能力进行测定的方法，所述方法包括以下步骤：
a)将以下物质引入第一容器：
-携带一种或多种GPCR以及一种或多种G蛋白的膜制剂，
-GDP源或GTP源，
-用RET伴侣对的第一成员标记的G蛋白α亚基(Gα蛋白)的第一配体以及用RET伴侣对的第二成员标记的Gα蛋白的第二配体，所述配体能够单独地或组合地特异性结合空Gα蛋白或全Gα蛋白；
b)测量所述第一容器中发射的RET信号；
c)(i)将测试分子以及与步骤a)中相同的试剂引入第二容器中，或者(ii)将所述测试分子引入所述第一容器中；
d)测量在步骤c)中获得的所述第一容器中或所述第二容器中发射的RET信号；
e)比较在步骤b)和步骤d)中获得的信号；
-当使用能够特异性结合空Gα蛋白的配体以及GDP源时，信号增加表明所述分子为GPCR激动剂；
-当使用能够特异性结合空Gα蛋白的配体以及GDP源时，信号降低表明所述分子为GPCR反向激动剂；
-当使用能够特异性结合全Gα蛋白的配体以及GDP源时，信号降低表明所述分子为GPCR激动剂；
-当使用能够特异性结合全Gα蛋白的配体以及GDP源时，信号增加表明所述分子为GPCR反向激动剂；
-当使用能够特异性结合空Gα蛋白的配体以及GTP源时，信号增加表明所述分子为GPCR激动剂；
-当使用能够特异性结合空Gα蛋白的配体以及GTP源时，信号降低表明所述分子为GPCR反向激动剂；
-当使用能够特异性结合全Gα蛋白的配体以及GTP源时，信号降低表明所述分子为GPCR激动剂；
-当使用能够特异性结合全Gα蛋白的配体以及GTP源时，信号增加表明所述分子为GPCR反向激动剂。


2.一种对分子调控G蛋白偶联受体(GPCR)的活化的能力进行测定的方法，所述方法包括以下步骤：
a)将以下物质引入第一容器：
-携带一种或多种GPCR以及一种或多种G蛋白的膜制剂，
-GDP源或GTP源，
-用RET伴侣对的第一成员标记的G蛋白α亚基(Gα蛋白)的第一配体以及用RET伴侣对的第二成员标记的Gα蛋白的第二配体，所述配体能够单独地或组合地特异性结合空Gα蛋白或全Gα蛋白；
-GPCR激动剂；
b)测量所述第一容器中发射的RET信号；
c)将测试分子以及与步骤a)中相同的试剂引入第二容器中；
d)测量在步骤c)中获得的所述第二容器中发射的RET信号；
e)比较在步骤b)和步骤d)中获得的信号；
-当使用能够特异性结合空Gα蛋白的配体以及GDP源时，信号增加表明所述分子为GPCR激动剂或正变构调节剂；
-当使用能够特异性结合全Gα蛋白的配体以及GDP源时，信号降低表明所述分子为GPCR激动剂或正变构调节剂；
-当使用能够特异性结合空Gα蛋白的配体以及GTP源时，信号增加表明所述分子为GPCR激动剂或正变构调节剂；
-当使用能够特异性结合全Gα蛋白的配体以及GTP源时，信号降低表明所述分子为GPCR激动剂或正变构调节剂；
-当使用能够特异性结合空Gα蛋白的配体以及GDP源时，信号降低表明所述分子为GPCR拮抗剂或负变构调节剂；
-当使用能够特异性结合全Gα蛋白的配体以及GDP源时，信号增加表明所述分子为GPCR拮抗剂或负变构调节剂；
-当使用能够特异性结合空Gα蛋白的配体以及GTP源时，信号降低表明所述分子为GPCR拮抗剂或负变构调节剂；
-当使用能够特异性结合全Gα蛋白的配体以及GTP源时，信号增加表明所述分子为GPCR拮抗剂或负变构调节剂。


3.如权利要求1或2所述的方法，其中，所述Gα蛋白选自以下蛋白：Gαi1、Gαi2、Gαi3、Gαo1、Gαo2、Gαq、...

【专利技术属性】
技术研发人员：托马斯·法比安·米歇尔·鲁，梅兰妮·达·席尔瓦，埃洛迪·朱莉·迪皮伊，埃里克·雅克·克里斯蒂安·特林凯，朱莉安·珍马吕斯·苏尔，菲利普·龙达，珍菲利普·R·珀，
申请(专利权)人：CISBIO生物试验公司，法国国家科学研究中心，
类型：发明
国别省市：法国;FR