检测形成β-片层聚集体的蛋白质的β-片层聚集体形式的方法技术

本发明专利技术涉及一种用于检测样品中形成β

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】检测形成
β
‑
片层聚集体的蛋白质的
β
‑
片层聚集体形式的方法


[0001]本专利技术涉及一种用于在样品中检测形成β
‑
片层聚集体的蛋白质的β
‑
片层聚集体形式(PAFβ)的体外方法，包括解聚PAFβ以获得形成β
‑
片层聚集体的蛋白质的β
‑
片层非聚集体形式(PNAFβ)的步骤和测量PNAFβ含量的步骤。

技术介绍

[0002]经常错误折叠的蛋白质的积累导致它们在细胞中聚集，造成细胞失调，表征为某些神经退行性病变；特别是β淀粉样肽，以及更特别是β1
‑
42淀粉样肽，其被广泛研究在阿尔茨海默病中用于形成含有β片层的原纤维、之后形成板。β淀粉样肽的聚集过程已被充分表征，该过程取决于许多因素，特别是其浓度、pH和温度。许多其他蛋白质(如含有朊病毒样结构域的RNA和DNA结合蛋白)也可以形成朊病毒样聚集体[1]。含有朊病毒样结构域的蛋白质是形成β
‑
片层聚集体的蛋白质(PFβ)。
[0003]朊病毒样结构域含疏水性氨基酸，这促进形成富含β片层的原纤维。形成β
‑
片层聚集体的蛋白质的β
‑
片层聚集体形式(PAFβ)在中性pH值时不溶于水。
[0004]目前对PAFβ诱发的这些神经退行性疾病的诊断最常基于影像学，并完成临床和神经心理学检查。这是需要若干诊断步骤的繁琐且昂贵的过程。
[0005]文献中也描述了允许证实或量化生物样品中PFβ聚集或寡聚的各种诊断技术。
[0006]某些PFβ，特别是β淀粉样肽和TAU或TDP
‑
43蛋白的不同聚集水平可以通过结构分析技术突出：电子显微镜、原子力显微镜、Cryo EM、圆二色性、核磁共振、X射线衍射。然而，这些技术使得难以测量在样品中存在的聚集体的含量，甚至是相对含量。因此，这些技术无法真正研究化合物对PFβ聚集水平的可能作用(特别是对聚集的抑制)。
[0007]能够根据蛋白质分子量将蛋白质分离的技术允许区分出高分子量的PAFβ和低分子量的PNAFβ。其中的一些还允许区分出不同尺寸的聚集体。例如，可以提及与蛋白印迹检测相关或不相关的聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE和SDS
‑
PAGE)。然而，目前在这些技术中描述的实验条件可以扭曲对聚集水平的测量。对于SDS
‑
PAGE而言尤其如此，其中对洗涤剂和还原剂(DTT、β
‑
巯基乙醇或TCEP)的组合使用可以将聚集体全部解聚或部分解聚。由于其实验限制(实施时间、大量样品、缺乏灵敏度)，这些技术并不真正适合用于表征能够调节PFβ聚集水平的化合物。
[0008]还描述了基于免疫检测的技术：
[0009]‑
过滤与免疫检测相结合：在这种方法中，生物样品在能够保留高分子量物质，特别是PAFβ的膜上过滤。然后，将比色或荧光或甚至发光示踪剂直接或间接标记的特异于PAFβ的抗体施加至膜上。测量的信号与PAFβ的量成正比。这种方法可以适用于微孔板形式，以研究淀粉样蛋白的聚集参数或化合物对淀粉样蛋白聚集水平的作用。然而，由于该技术所需的过滤和洗涤步骤，该方法的自动化和通量受到限制[2]。
[0010]‑
ELISA：已经描述了不同的ELISA测试策略，以便允许表征PFβ的聚集。第一策略包括使用相同的抗体在固相上捕获PAFβ，以及使用允许其检测的示踪剂。这种方法只允许检
测具有若干个用于捕获和检测的抗体表位的PAFβ。相反地，因为PNAFβ只有一个能被所用抗体识别的表位，所以捕获抗体和检测抗体不能同时固定在PNAFβ上。因此，在PNAFβ存在的情况下不会产生任何信号[3]。第二策略包括在ELISA测试中将特异性识别PAFβ的抗体与识别样品中存在的全部PFβ形式(PAFβ和PNAFβ)的抗体相结合[4]。在这种形式中，PAFβ的特异性抗体通常是捕获抗体，但也描述了使用其作为检测抗体的形式[5]。第三个策略是使用两种不同的都识别感兴趣的PAFβ的抗体。最后一个策略似乎可以提高对聚集体检测的特异性[6]。所有这些ELISA测试都可以确定感兴趣的PFβ的聚集水平，并确定化合物对其聚集水平的作用。然而，仅检测PAFβ是不够的，因为在给定的信号中，不可能实现与初始状态相比的聚集水平，除非将测量与标准范围进行比较，这必然会使受测的生物样品的测量产生偏差。
[0011]‑
TR
‑
FRET(时间分辨的能量转移)：已经开发并上市销售基于此方法的试剂盒，以检测在有机样品中TAU和α
‑
突触核蛋白的聚集(参见Cisbio网站，商业参考号6FTAUPEG和6FASYPEG)。这些测试分别使用荧光供体和接受体标记相同的抗体。在PAFβ存在的情况下，由于聚集，两种标记的抗体将同时与PAFβ键合，从而在彼此靠近的供体和荧光接受体之间诱导能量转移。然后，接受体抗体将发出特定的FRET信号，其将在分辨时间内得到测量。另一方面，两个抗体中只有一个可以结合到PNAFβ上，从而阻止了供体和接受体之间的任何靠近。然后，就不可能在PNAFβ上获得FRET信号。这些试剂盒允许确定感兴趣的PFβ的聚集水平，以及确定在小型化和高速模式下化合物对感兴趣的PFβ聚集水平的作用。然而，这些试剂盒需要使用能够识别PFβ表位(即使所述表位聚集)的抗体，这有时会限制甚至阻碍检测测试的开发，因为免疫通常是用PNAFβ进行的，这会使得难以获得抗PAFβ抗体。
[0012]因此，现有技术中描述的方法旨在直接检测样品中的PAFβ，特别是通过使用PAFβ的一种或更多种配体。然而，直接检测PAFβ可能使这些技术难以实施、不精确和/或不适合大规模使用。此外，仅检测PAFβ是不够的，因为在给定的信号中，不可能实现与初始状态相比较的聚集水平，除非将测量与标准范围进行比较，这必然会使测试的生物样品的测量产生偏差。
[0013]因此，有必要对与PFβ聚集相关的疾病进行更简单、更快速和更可靠的诊断。
[0014]申请人已经开发了一种简单且易于实施的操作方案，其允许解聚样品中存在的全部或一部分PAFβ，以获得PNAFβ。该操作方案允许申请人开发通过测量PNAFβ的含量进行的PAFβ检测方法，这允许克服与PAFβ检测相关的所有约束。

技术实现思路

[0015]根据第一方面，本专利技术涉及一种用于检测样品中形成β
‑
片层聚集体的蛋白质的β
‑
片层聚集体形式(PAFβ)的体外方法，包括以下步骤：
[0016]a)在第一容器中：
[0017]a1)引入可能含有PAFβ的样品，
[0018]a2)将pH调节至pH 9.7至13.2的范围内，以解聚全部或一部分的PAFβ，以获得形成β
‑
片层聚集体的蛋白质的β
‑
片层非聚集体形式(PNAFβ)，
[0019]a3本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.一种用于检测样品中形成β
‑
片层聚集体的蛋白质的β
‑
片层聚集体形式(PAFβ)的体外方法，其包括以下步骤：a)在第一容器中：a1)引入可能含有PAFβ的样品，a2)将pH调节至pH 9.7至13.2的范围内，以解聚全部或一部分的PAFβ，以获得形成β
‑
片层聚集体的蛋白质的β
‑
片层非聚集体形式(PNAFβ)，a3)将pH调节至pH 6至9的范围，b)用合适的免疫学方法测量所述第一容器中的PNAFβ的含量；c)在第二容器中：c1)引入与步骤a1)中相同的样品，c2)将pH调节至pH 6至9的范围；d)使用与步骤b)中相同的方法测量所述第二容器中的PNAFβ的含量；e)比较步骤b)和d)中测量的含量，步骤d)中测量的含量低于步骤b)中测量的含量，指示所述样品含有PAFβ。2.根据权利要求1所述的方法，其中所述形成β
‑
片层聚集体的蛋白质(PFβ)选自FUS(在肉瘤中的融合蛋白)、TAF15、EWSR1、DAZAP1、TIA
‑
1、TTR(转甲状腺素蛋白)、胱抑素C、β2
‑
微球蛋白、β淀粉样肽(如β1
‑
40淀粉样肽或β1
‑
42淀粉样肽)、TAU(微管蛋白相关单元)、SOD1(超氧化物歧化酶1)、α
‑
突触核蛋白、γ
‑
突触核蛋白、亨廷顿蛋白(HTT)、朊病毒和TDP
‑
43(TAR DNA结合蛋白)。3.根据权利要求1或2中任一项所述的方法，其中所述PFβ选自β1
‑
42淀粉样蛋白、α
‑
突触核蛋白和TDP
‑
43。4.根据权利要求1至3中任一项所述的方法，其中所述样品来自患有或疑似患有PAFβ相关疾病的个体。5.根据权利要求1至4中任一项所述的方法，其中所述样品来自体外培养的细胞或组织。6.根据权利要求1至4中任一项所述的方法，其中所述样品选自血液样品、血浆样品、血清样品、脑脊液样品、细胞裂解物、细胞匀浆、组织裂解物或组织匀浆，如脑匀浆。7.根据权利要求1至3或5中任一项所述的方法，其中所述样品选自细胞裂解物、细胞匀浆、组织裂解物、组织匀浆、细胞培养上清液、组织培养上清液、细胞亚组分或蛋白质(天然的或重组的)。8.根据权利要求1至7中任一项所述的方法，其中步骤a2)中的pH用碱，如NaOH调节。9.根据权利要求1至8中任一项所述...

【专利技术属性】
技术研发人员：E，
申请(专利权)人：CISBIO生物试验公司，
类型：发明
国别省市：