一种CD22纳米抗体的筛选方法技术

本发明专利技术涉及生物医药技术领域，具体涉及一种CD22纳米抗体的筛选方法。本发明专利技术CD22纳米抗体筛选过程中，采用流式分选结合亲和力检测的方式，筛选出具有高的结合特异性的CD22纳米抗体，并且通过特定核苷酸突变修饰的人源化处理，提高CD22纳米抗体的稳定性和安全性。采用本发明专利技术筛选的CD22纳米抗体可以作为药物活性成分，或者靶向药物的联合结构，或者免疫效应细胞的靶向结合区域序列结构，或者诊断试剂成分，制备获得能够预防和治疗肿瘤的药物组合物，或者能够诊断肿瘤的诊断试剂。

【技术实现步骤摘要】
一种CD22纳米抗体的筛选方法
本专利技术涉及生物医药
，具体涉及一种CD22纳米抗体的筛选方法。
技术介绍
1975年杂交瘤技术的问世拉开了单克隆抗体用于人类疾病诊断与治疗的序幕，然而单抗体积大、稳定性差，并具有免疫源性，使其在临床上的应用受到一定限制。20世纪80年代以后，新型基因工程抗体不断出现，包括嵌合抗体、人源化抗体、全人源化抗体和小型化基因工程抗体，单域抗体是一种小型化基因工程抗体，但是它在稳定性、表达产量、蛋白酶抵抗性和聚合性方面仍有待改进。1993年hamers-casterman报道了在骆驼科动物体内发现了一种天然缺失轻链的抗体，即重链抗体，其抗原结合位点仅由重链的可变区（VHH）构成，成为VHH抗体，是目前可以得到的具有完整功能的最小抗体分子片段。一般来说，scFV相对分子质量约为30KD，而VHH抗体的相对分子质量为15KD，仅为常规抗体的1/10，其分子高度4.8nm，直径为2.2nm，故又成为纳米抗体。与常规抗体相比，纳米抗体具有诸多优势：1）分子量小，可穿透血脑屏障，较易作用于病灶区；2）在原核或者真核系统中可高表达；3）特异性强、亲和力高；4）高耐热性和化学稳定性；5）对人的免疫原性弱。CD22是B细胞抑制性共受体之一，表达于正常的前B细胞表面，而在浆细胞表面的表达则明显减少。CD22在各种非霍奇金淋巴瘤（NHL）中均有表达。抗CD22抗体与CD22结合后能够迅速通过内吞作用进入细胞，为特异性靶向肿瘤细胞药物提供了很好的运输载体。相比其他潜在靶点，CD22是更理想的适合通过抗体-药物偶联物（ADC）治疗恶性B细胞淋巴瘤的靶点。目前以CD22为靶点研发的ADC在临床试验阶段均显示出一定疗效，其所具有的高效、安全和药代动力学特征使其有望成为靶向CD22治疗NHL的新药。因此构建筛选抗原结合特异性好，稳定好的CD22纳米抗体对以CD22为靶点的药物的研发，相关肿瘤疾病的预防、诊断和治疗具有重要的前景意义。
技术实现思路
为了克服现有技术的缺陷，本专利技术的目的之一在于提供一种CD22纳米抗体的筛选方法，筛选出的CD22纳米抗体对靶向抗原CD22具有高的结合特异性、稳定性和安全性。为了实现上述目的，本专利技术采用的技术方案如下：一种CD22纳米抗体的筛选方法，包括以下操作步骤：1）细胞免疫：用人CD22重组蛋白对羊驼进行冲击免疫，检测羊驼血清的免疫效价符合要求后，采集冲击免疫后的羊驼的外周血；2）细胞分选：从步骤1）采用的外周血分离PBMC细胞，采用CD22重组蛋白孵育PBMC细胞，流式细胞分选双阳性单个细胞；3）单域抗体克隆及测序：孵育步骤2）分选的细胞，提取RNA，测序获得单域抗体编码区序列；4）单域抗体筛选：根据步骤3）测序获得的序列信息进行基因合成，亚克隆至带有Fc标签的单域抗体表达载体中，并表达单域抗体；筛选与靶蛋白CD22具有高结合力和亲和力的单域抗体，纯化单域抗体，即得CD22纳米抗体；其中筛选的单域抗体的氨基酸序列如SEQNO：9所示，编码该单域抗体的核苷酸序列如SEQNO：8所示。可选的，细胞免疫前还包括制备人CD22重组蛋白：人工基因合成人CD22胞外段氨基酸序列，构建CD22重组蛋白真核表达载体，转染CHO-S细胞表达CD22重组蛋白，纯化获得人CD22重组蛋白；进一步的，步骤1）中免疫效价的要求为ELISA免疫效价达到1:160000以上。更进一步的，步骤1）中用人CD22重组蛋白对羊驼进行冲击免疫前已对羊驼进行了四次免疫。在本专利技术的一些实施例中，步骤2）中使用Biotin偶联的CD22重组蛋白孵育PBMC细胞，同时孵育APC-Streptavidn以及FITC-Anti-CamelidVHH抗体，流式细胞分选FITC和APC双阳性的单个细胞。在本专利技术的一些实施例中，步骤3）中提取RNA后还包括逆转录为cDNA，使用单域抗体扩增引物进行PCR，产物经琼脂糖凝胶电泳分离，对分离的400bp左右的PCR产物进行测序。进一步的，步骤4）中表达单域抗体和筛选的具体方法为：将构建的单域抗体表达载体转染至293F细胞中表达单域抗体；对表达获得的单域抗体采用ELISA及流式细胞验证候选单域抗体与靶蛋白的结合，从中挑选流式检测信号值最高的1个克隆，表达纯化抗体，即为CD22纳米抗体。为了进一步降低CD22纳米抗体的免疫原性，还包括表面氨基酸替换的设计对步骤4）筛选的CD22纳米抗体进行人源化；其中筛选获得的人源化抗体的氨基酸替换设计为1E、37V、44G、45L、119Q，其氨基酸序列如SEQNO:10所示；对应的编码相应的人源化抗体的核苷酸序列如SEQNO：12所示。在本专利技术的另一个实施例中，筛选获得的人源化抗体的氨基酸设计为1E、37V、44G、45L、119Q、47W，其氨基酸序列如SEQNO：11所示；对应的编码相应的人源化抗体的核苷酸序列如SEQNO：13所示在本专利技术的具体实施例方式中，步骤4）筛选的CD22纳米抗体进行人源化的具体方法包括以下操作步骤：（a）人源化抗体设计及基因制备：采用表面氨基酸替换的设计对筛选的CD22纳米抗体进行人源化，获得并合成人源化抗体序列后，构建人源化单域抗体表达载体；对上述制备的人源化单域抗体表达载体进行质粒大量抽提，制备转染级别的质粒。（b）人源化抗体表达及纯化：将步骤（a）制备的转染级别的质粒通过瞬时转染至293F细胞中，表达并纯化人源化CD22纳米抗体；（c）人源化抗体筛选：对步骤（b）制备的人源化抗体的结合特异性及亲和力检测，亲和力达到10-9M，即得人源化抗体。本专利技术CD22纳米抗体筛选过程中，采用流式分选结合亲和力检测的方式，筛选出具有高的结合特异性的CD22纳米抗体，并且通过特定核苷酸突变修饰的人源化处理，提高CD22纳米抗体的稳定性和安全性。采用本专利技术筛选的CD22纳米抗体可以作为药物活性成分，或者靶向药物的联合结构，或者免疫效应细胞的靶向结合区域序列结构，或者诊断试剂成分，制备获得能够预防和治疗肿瘤的药物组合物，或者能够诊断肿瘤的诊断试剂。附图说明图1为实施例1中流式分选FITC和APC双阳性的单个细胞检测结果示意图；图2为实施例1中流式检测结果示意图；其中CHO-K1为不表达CD22蛋白的原始细胞，CHO-K1-CD22为表达CD22蛋白的细胞；图3为实施例2中不同人源化CD22纳米抗体的流式检测结果对比图；其中H10-2-1为氨基酸替换设计为1E、37V、44G、45L、119Q的人源化CD22纳米抗体；H10-2-2为氨基酸替换设计为1E、34M、35S、37V、44G、45L、47W、119Q的人源化CD22纳米抗体；H10-2-3为氨基酸替换设计为1E、34M、35S、37V、44G、45L、47W、50A、119Q的人源化CD22纳米抗体；H10-2-4为氨基酸替换设计为1E、37V、44G、45L本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种CD22纳米抗体的筛选方法，其特征在于，包括以下操作步骤：/n1）细胞免疫：用人CD22重组蛋白对羊驼进行冲击免疫，检测羊驼血清的免疫效价符合要求后，采集冲击免疫后的羊驼的外周血；/n2）细胞分选：从步骤1）采用的外周血分离PBMC细胞，采用CD22重组蛋白孵育PBMC细胞，流式细胞分选双阳性单个细胞；/n3）单域抗体克隆及测序：孵育步骤2）分选的细胞，提取RNA，测序获得单域抗体编码区序列；/n4）单域抗体筛选：根据步骤3）测序获得的序列信息进行基因合成，亚克隆至带有Fc标签的单域抗体表达载体中，并表达单域抗体；筛选与靶蛋白CD22具有高结合力和亲和力的单域抗体，纯化单域抗体，即得CD22纳米抗体；/n其中筛选的单域抗体的氨基酸序列如SEQ NO：9所示，编码该单域抗体的核苷酸序列如SEQ NO：8所示。/n

【技术特征摘要】
1.一种CD22纳米抗体的筛选方法，其特征在于，包括以下操作步骤：
1）细胞免疫：用人CD22重组蛋白对羊驼进行冲击免疫，检测羊驼血清的免疫效价符合要求后，采集冲击免疫后的羊驼的外周血；
2）细胞分选：从步骤1）采用的外周血分离PBMC细胞，采用CD22重组蛋白孵育PBMC细胞，流式细胞分选双阳性单个细胞；
3）单域抗体克隆及测序：孵育步骤2）分选的细胞，提取RNA，测序获得单域抗体编码区序列；
4）单域抗体筛选：根据步骤3）测序获得的序列信息进行基因合成，亚克隆至带有Fc标签的单域抗体表达载体中，并表达单域抗体；筛选与靶蛋白CD22具有高结合力和亲和力的单域抗体，纯化单域抗体，即得CD22纳米抗体；
其中筛选的单域抗体的氨基酸序列如SEQNO：9所示，编码该单域抗体的核苷酸序列如SEQNO：8所示。


2.如权利要求1所述的CD22纳米抗体的筛选方法，其特征在于，细胞免疫前还包括制备人CD22重组蛋白：人工基因合成人CD22胞外段氨基酸序列，构建CD22重组蛋白真核表达载体，转染CHO-S细胞表达CD22重组蛋白，纯化获得人CD22重组蛋白。


3.如权利要求1或2所述的CD22纳米抗体的筛选方法，其特征在于，步骤1）中免疫效价的要求为ELISA免疫效价达到1:160000以上。


4.如权利要求3所述的CD22纳米抗体的筛选方法，其特征在于，步骤1）中用人CD22重组蛋白对羊驼进行冲击免疫前已对羊驼进行了四次免疫。


5.如权利要求3所述的CD22纳米抗体的筛选方法，其特征在于，步骤2）中使用Biotin偶联的CD22重组蛋白孵育PBMC细胞，同时孵育APC-Streptavidn以及FITC-Anti-CamelidVHH抗体，流式细胞分选FITC和APC双阳性的单个细胞。


6.如权利要求3所述的CD22纳米抗体的筛选方法，其特征在于，步骤3）中提取RNA后还包括逆转录为cDNA，使用单域抗体扩增引物...

【专利技术属性】
技术研发人员：韦丹，秦志华，王贺，李明志，
申请(专利权)人：河南创新生物科技研究院有限公司，
类型：发明
国别省市：河南;41