FAP基因人源化的非人动物的构建方法及应用技术

本发明专利技术提供了一种FAP基因人源化非人动物的构建方法，利用同源重组的方式将编码人FAP蛋白的核苷酸序列导入非人动物基因组中，该动物体内能正常表达人或人源化FAP蛋白，可以作为人FAP信号机理研究、肿瘤及免疫相关疾病药物筛选的动物模型，对免疫靶点的新药研发具有重要的应用价值。本发明专利技术还提供了一种人源化FAP蛋白、一种人源化FAP基因、一种FAP基因的靶向载体、一种FAP基因人源化的非人动物、一种FAP基因人源化的细胞以及其在生物医药领域的应用。应用。应用。

【技术实现步骤摘要】
FAP基因人源化的非人动物的构建方法及应用


[0001]本专利技术属于动物基因工程和基因遗传修饰领域，具体地说，涉及一种FAP基因人源化非人动物的构建方法及其在生物医药领域的应用。

技术介绍

[0002]成纤维细胞活化蛋白(fibroblast activation protein alpha，简称FAP)是一种II型膜结合丝氨酸蛋白酶，同源二聚体具有活性，单体无活性。FAP是一种在大多数正常成人组织中低水平表达的细胞表面蛋白，但在常见癌症中过度表达，特别是在形成肿瘤基质的癌相关成纤维细胞上，而肿瘤基质是肿瘤生长所必需的。癌相关成纤维细胞上FAP的高表达通常与实体瘤的不良预后相关。在组织病理学研究中发现，90％以上的上皮肿瘤中发现了FAP阳性的癌症相关成纤维细胞，而正常组织成纤维细胞极少甚至不表达FAP，这使得FAP成为各种恶性肿瘤成像和治疗的潜在靶点。
[0003]目前，以FAP为治疗靶点的治疗策略主要有单克隆抗体、FAP酶活抑制剂、FAP激活式靶向前体药物和DNA疫苗。西罗珠单抗(Sibrotuzumab)为Boehringer Ingelheim开发的单克隆抗体，其作为最先进入临床的FAP抗体2002年进入临床，未达到预计终点项目已暂停。罗氏FAP抗体有多个研发管线，以双抗为主包括FAP
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OX40双抗，FAP抗体
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1BBL、FAP抗体
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IL
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2用于肿瘤治疗，FAP抗体
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IL
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10用于肠炎IBD的治疗。FAP抗体
‑4‑
1BBL目前处于临床I/II期。基本上均处于临床前研发阶段。FAP抗体药物和FAP酶活抑制剂在目前的临床研究中效果有限。
[0004]实验动物疾病模型对于研究人类疾病发生的病因、发病机制、开发防治技术和治疗药物是不可缺少的研究工具。常见的实验动物包括小鼠、大鼠，豚鼠，地鼠(仓鼠)，兔，犬，猴，猪，鱼等。然而，人类和动物的基因和蛋白质序列还是存在不少差异，许多人类蛋白质不能与动物的同源蛋白质结合而产生生物活性，导致许多临床试验的结果也与动物实验的结果不相符。大量的临床研究急需更好的动物模型。
[0005]然而，由于动物与人类在生理学及病理学方面存在差异，加上基因的复杂性，例如，人和小鼠FAP蛋白的一致性为89.488％，如何能构建出“有效”的人源化动物模型用于新药研发仍是最大的挑战。
[0006]鉴于FAP复杂的作用机制，以及在肿瘤治疗领域的巨大应用价值，为进一步探索其相关生物学特性，提高临床前期药效试验的有效性，提高研发成功率，使临床前期的试验更有效并使研发失败最小化，本领域急需开发FAP相关信号通路的非人动物模型。此外，本方法得到的非人动物还可与其它基因人源化非人动物交配得到多基因人源化动物模型，用于筛选和评估针对该信号通路的人用药及联合用药的药效研究。本专利技术在学术和临床研究中具有广阔的应用前景。

技术实现思路

[0007]本申请用人源正常或突变基因替换动物基因组的同源基因，可建立更接近人类生
理或疾病特征的正常或突变基因动物模型。基因人源化动物不但本身具有重要应用价值，如通过基因人源化可改进和提升细胞或组织移植人源化动物模型，更重要的是，由于人类基因片段的插入，动物体内可表达或部分表达人源蛋白，可作为仅能识别人蛋白序列的药物的靶点，为在动物水平进行抗人抗体及其它药物的筛选提供了可能。
[0008]本专利技术的第一方面，提供了一种人源化FAP蛋白，所述的人源化FAP蛋白包含人FAP蛋白的全部或部分。
[0009]优选的，所述的人源化FAP蛋白包含人FAP蛋白的胞外区、跨膜区和/或胞质区的全部或部分。
[0010]进一步优选的，所述人源化FAP蛋白包含人FAP蛋白的胞外区的全部或部分。
[0011]在本专利技术的一个具体实施方式中，所述的人源化FAP蛋白包含人FAP蛋白的至少20个到至少760个氨基酸序列，例如至少20、30、40、50、60、70、80、90、100、200、300、400、500、600、700、710、720、725、729、730、735、740、750、760个连续氨基酸序列。
[0012]在本专利技术的一个具体实施方式中，所述的人源化FAP蛋白包含人FAP蛋白的胞外区至少20个到至少735个，例如至少20、30、40、50、60、70、80、90、100、200、300、400、500、600、700、710、720、725、729、730、735个连续氨基酸序列。
[0013]在本专利技术的一个具体实施方式中，所述的人源化FAP蛋白包含N端去除0
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10(例如0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10)个氨基酸序列的人FAP蛋白胞外区。
[0014]进一步优选所述人源化FAP蛋白包含非人动物内源FAP蛋白的胞外区的部分。
[0015]优选的，所述的非人动物内源FAP蛋白的胞外区的部分包含SEQ ID NO：1的第26
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31位所示氨基酸序列；或者，包含与SEQ ID NO：1的第26
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31位所示氨基酸序列同一性至少为90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％的氨基酸序列。
[0016]在本专利技术的一个具体实施方式中，所述的人源化FAP蛋白包含非人动物内源FAP蛋白的胞外区的N端的0
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10(例如0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10)个氨基酸。
[0017]在一些具体实施方式中进一步优选的，所述的人源化FAP蛋白还包含非人动物内源FAP蛋白的跨膜区和/或胞质区的全部或部分。
[0018]进一步优选的，所述的非人动物内源FAP蛋白的跨膜区包含SEQ ID NO：1的第5
‑
25位所示氨基酸序列；或者，包含与SEQ ID NO：1的第5
‑
25位所示氨基酸序列同一性至少为90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％的氨基酸序列。
[0019]进一步优选的，所述的非人动物内源FAP蛋白的胞质区包含SEQ ID NO：1的第1
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4位所示氨基酸序列；或者，包含与SEQ ID NO：1的第1
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4位所示氨基酸序列同一性至少为90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％的氨基酸序列。
[0020]优选的，所述的人FAP蛋白的部分和非人动物内源FAP蛋白的部分直接连接或者通过接头连接，所述的接头优选为肽接头。
[0021]在一些具体实施方式中，所述的人源化FAP蛋白的32至760位氨基酸序列为人FAP蛋白的32至760位氨基酸序列，其余为非人动物内源FAP蛋白的氨基酸序列。
[0022]在本专利技术的一个具体实施方式中，所述的人源化FAP蛋白按N端到C端的顺序包本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种FAP基因人源化的非人动物的构建方法，其特征在于，所述的非人动物体内表达人或人源化FAP蛋白，和/或，所述非人动物基因组中包含人FAP基因的部分或人源化FAP基因；优选的，所述的人源化FAP蛋白包含人FAP蛋白的全部或部分；进一步优选包含人FAP蛋白的胞外区、跨膜区和/或胞质区的全部或部分；进一步优选的，所述的人源化FAP蛋白包含人FAP蛋白胞外区的全部或部分；更优选包含人FAP蛋白的胞外区至少20个连续氨基酸；更进一步优选包含SEQ ID NO：2第32
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760位所示氨基酸序列；或者，包含与SEQ ID NO：2第32
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760位所示氨基酸序列同一性至少为90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％的氨基酸序列；优选的，所述的人源化FAP基因包含人FAP基因的部分；优选的，所述的人FAP基因的部分包含人FAP基因的1号至26号外显子的全部或部分，进一步优选包含人FAP基因的3号外显子的部分、4号至25号外显子的全部和26号外显子的部分，其中，人FAP基因的3号外显子的部分至少包含50bp的连续核苷酸序列，人FAP基因的26号外显子的部分至少包含编码区的核苷酸序列；更进一步优选包含SEQ ID NO：5所示核苷酸序列；或者，包含与SEQ ID NO：5所示的核苷酸序列同一性至少为90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％的核苷酸序列。2.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述的非人动物内源FAP蛋白表达降低或缺失。3.根据权利要求1或2所述的构建方法，其特征在于，所述的构建方法包括将包含下列组中的任一种核苷酸序列导入非人动物内源FAP基因座：A)人FAP基因的部分，优选包含人FAP基因的1号至26号外显子的全部或部分，进一步优选包含人FAP基因的3号外显子的部分、4号至25号外显子的全部和26号外显子的部分，其中，人FAP基因的3号外显子的部分至少包含50bp的连续核苷酸序列，人FAP基因的26号外显子的部分至少包含编码区的核苷酸序列；更进一步优选包含SEQ ID NO：5所示核苷酸序列；或者，包含与SEQ ID NO：5所示的核苷酸序列同一性至少为90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％的核苷酸序列；B)编码人FAP蛋白的全部或部分核苷酸序列，优选包含编码人FAP蛋白的胞外区、跨膜区和/或胞质区的全部或部分核苷酸序列；进一步优选包含编码人FAP蛋白的胞外区的全部或部分核苷酸序列；更进一步优选包含编码人FAP蛋白的胞外区至少20个连续氨基酸的核苷酸序列；再进一步优选包含编码SEQ ID NO：2第32
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760位所示氨基酸序列的核苷酸序列；或者，包含与编码SEQ ID NO：2第32
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760位所示氨基酸序列的核苷酸序列同一性至少为90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％的核苷酸序列；C)编码人源化FAP蛋白的核苷酸序列；或，D)人源化FAP基因的核苷酸序列。4.根据权利要求1
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3任一所述的构建方法，其特征在于，人FAP基因的部分或人源化FAP基因在非人动物体内通过内源调控元件进行调控。5.根据权利要求1
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4任一所述的构建方法，其特征在于，所述的导入为替换或插入；优选的，所述的导入非人动物内源FAP基因座为替换非人动物相应区域，进一步优选的非人动物内源FAP基因的3号至26号外显子全部或部分被替换。
6.根据权利要求1
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5任一所述的构建方法，其特征在于，所述的构建方法包括使用靶向载体进行非人动物的构建；优选的，所述的靶向载体包含下列组中的任一种：A)人FAP基因的部分，优选包含人FAP基因的1号至26号外显子的全部或部分，进一步优选包含人FAP基因的3号外显子的部分、4号至25号外显子的全部和26号外显子的部分，其中，人FAP基因的3号外显子的部分至少包含50bp的连续核苷酸序列，人FAP基因的26号外显子的部分至少包含编码区的核苷酸序列；更进一步优选包含SEQ ID NO：5所示核苷酸序列；或者，包含与SEQ ID NO：5所示的核苷酸序列同一性至少为90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％的核苷酸序列；B)编码人FAP蛋白的全部或部分核苷酸序列，优选包含编码人FAP蛋白的胞外区、跨膜区和/或胞质区的全部或部分核苷酸序列；进一步优选包含编码人FAP蛋白的胞外区的全部或部分核苷酸序列；更进一步优选包含编码人FAP蛋白的胞外区至少20个连续氨基酸的核苷酸序列；再进一步优选包含编码SEQ ID NO：2第32
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760位所示氨基酸序列的核苷酸序列；或者，包含与编码SEQ ID NO：2第32
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760位所示氨基酸序列的核苷酸序列同一性至少为90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％的核苷酸序列；C)编码人源化FAP蛋白的核苷酸序列；或，D)人源化FAP基因的核苷酸序列。7.根据权利要求6所述的构建方法，其特征在于，所述的靶向载体还包含5
’
臂和/或3
’
臂；其中，所述的5
’
臂与NCBI登录号为NC_000068.8至少具有90％同源性的核苷酸；优选的，所述5
’
臂包含SEQ ID NO：3；所述的3
’
臂与NCBI登录号为NC_000068.8至少具有90％同源性的核苷酸；优选的，所述的3
’
臂包含SEQ ID NO：4。8.根据权利要求1
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7任一所述的构建方法，其特征在于，所述的构建方法进一步包括将FAP基因人源化的非人动物与其他基因修饰的非人动物交配、体外授精或直接进行基因编辑，并进行筛选，得到多基因修饰的非人动物；优选的，所述的其他基因选自PD
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1、PD
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L1、TIGIT、CD226、CD40、CD3、CD137、CD28、4
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1BB、IL
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2、OX40或IL
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10中的至少一种；优选的，所述的人源化FAP基因和/或其他基因对于内源被修饰基因座为纯合的；优选的，所述的人源化FAP基因和/或其他基因对于内源被修饰基因座为杂合的。9.一种人源化FAP蛋白，其特征在于，所述的人源化FAP蛋白包含人FAP蛋白的全部或部分。10.根据权利要求9所述的人源化FAP蛋白，其特征在于，所述的人源化FAP蛋白包含人FAP蛋白的胞外区、跨膜区和/或胞质区的全部或部分，优选包含人FAP蛋白胞外区的全部或部分；进一步优选包含人FAP蛋白的胞外区至少20个连续氨基酸；更优选包含SEQ ID NO：2第32
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760位所示氨基酸序列；或者，包含与SEQ ID NO：2第32
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760位所示氨基酸序列同一性至少为90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％的氨基酸序列。11.根据权利要求9或10...

【专利技术属性】
技术研发人员：张译夫，沈志远，聂琰晖，
申请(专利权)人：百奥赛图江苏基因生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：