一种基于LbCpf1变体的水稻碱基编辑系统和应用技术方案

本发明专利技术公开了一种基于LbCpf1变体的水稻碱基编辑系统和应用，该变体称为dLbCpf1。本发明专利技术的水稻碱基编辑系统包含了上述变体、crRNA和ABE8e，通过将本发明专利技术的碱基编辑系统转入生物体或生物细胞内，使dLbCpf1、crRNA和ABE8e的编码基因均得到表达，可以实现基因组靶点序列A:T到G:C的精准替换编辑。利用本发明专利技术的dCas12a融合ABE的碱基编辑系统，可以识别PAM序列为TTTV的靶点序列，从而在A/T富集区域内实现高效率和高精准度的定向碱基编辑，具有广泛的应用前景。泛的应用前景。泛的应用前景。

【技术实现步骤摘要】
一种基于LbCpf1变体的水稻碱基编辑系统和应用


[0001]本专利技术涉及生物技术和植物基因工程
具体而言，本专利技术涉及一种高效水稻碱基编辑系统及应用。

技术介绍

[0002]CRISPR/Cas9基因组编辑系统自问世以来，就有着其它基因组编辑技术无可比拟的优势，被认为能够在活细胞中广泛使用，并是迄今为止最有效、最便捷的基因组编辑系统。后来发现的CRISPR/Cpf1系统和CRISPR/Cas9系统同属CRISPR
‑
Cas Class2系统，但前者仅需要一条更短的crRNA即可实现基因编辑，更有潜力实现更简单、更精确的基因组工程操作。单个Cpf1蛋白在crRNA处理中起作用、靶位点识别和DNA切割。通过crRNA引导Cpf1蛋白找到目的DNA，通过Cpf1的Ruv核酸酶结构域和Nuc辅结构域进行切割。目前植物中有三种Cpf1：FnCpf1、LbCpf1和AsCpf1，而其中效率最高的是LbCpf1。LbCpf1可有效识别基因组中的TTTV(V＝A/C/G)序列作为PAM，从而靶向其下游序列。
[0003]Cas9核酸酶利用引导RNA(guide RNA，gRNA)可在多种细胞的基因组特定靶点定位，对其进行切割从而产生DNA双链断裂(double strand breaks，DSBs)，然后利用细胞内源的DNA修复机制来实现编辑。根据不同DNA修复通路的激活，将会导致基因的失活或者突变的校正，为了提高基因突变的校正效率，碱基编辑器(base editor，BE)应运而生。在2017年，刘如谦团队开发出了腺嘌呤碱基编辑器(adenine base editors,ABEs)，该工具能够实现腺嘌呤A到鸟嘌呤G的单碱基转换，2020年刘如谦团队在ABE7.10上继续升级，用噬菌体辅助进化生成了ABE8e(TadA
‑
8e V106W)，其编辑速度比ABE7.10快590倍，脱靶效应并没有显著提高。ABE系统由gRNA和融合蛋白构成，其中，融合蛋白一般由改造的Cas9蛋白(Cas9 nickase,Cas9n)和腺嘌呤脱氨酶组成。其原理为脱氨酶与Cas9切口酶(Cas9n)的N末端融合，在gRNA引导下，使非靶链中的腺苷脱氨，暴露为单链DNA(single
‑
stranded,ssDNA)，然后将腺嘌呤A转化为肌苷I(A
‑
to
‑
I)，最后，DNA聚合酶将肌苷I识别为鸟嘌呤G进行复制，而互补链上原来与腺嘌呤A互补的胸腺嘧啶T将会变成胞嘧啶C，进而完成碱基置换过程。但目前该系统仅利用nCas9蛋白突变体(Cas9 nicknase，nCas9)或dCas9蛋白突变体(deactivated Cas9，dCas9)作为效应蛋白，所识别的PAM序列为鸟嘌呤/胞嘧啶富集区。因此，利用现有的碱基编辑系统无法在水稻等植物的基因组上的腺嘌呤/胸腺嘧啶富集区域进行高效的编辑操作。

技术实现思路

[0004]为了解决上述问题，本专利技术提供一种能识别非G序列，且高效的碱基编辑系统，如将生物体或生物细胞中PAM序列为TTTV的靶点序列中的A:T突变成G:C。进而实现在水稻等植物的基因组上的腺嘌呤/胸腺嘧啶富集区域进行高效的编辑操作。
[0005]为解决上述技术问题，本专利技术首先提供一种识别PAM序列为TTTV dLbCpf1，其特征在于，所述dLbCpf1包含：
[0006](a)序列表中SEQ ID NO：1所示序列；
[0007](b)在SEQ ID NO:1中所示的核苷酸序列中取代一个或多个核苷酸且能够进行水稻基因组剪切的核苷酸序列；
[0008](c)在SEQ ID NO:1中所示的核苷酸序列中添加一个或多个核苷酸且能够进行水稻基因组剪切的核苷酸序列；或者
[0009](d)SEQ ID NO:1中所示的核苷酸序列缺失一个或多个核苷酸且能够进行水稻基因组剪切的核苷酸序列。
[0010]其中，dLbCpf1的DNA切割活性缺失。
[0011]另一方面，本专利技术提供一种基于LbCpf1变体的水稻碱基编辑系统，其特征在于，所述水稻碱基编辑系统包含所述LbCpf1变体，所述LbCpf1变体为dLbCpf1，其如序列表SEQ ID NO：1所示，其序列具体为：
[0012][0013][0014][0015]优选地，所述水稻碱基编辑系统包括所述dLbCpf1的编码基因、crRNA的DNA分子以及腺嘌呤脱氨酶ABE8e的编码基因；
[0016]所述crRNA靶向目标靶点序列；
[0017]所述目标靶点序列的PAM序列为TTTV。
[0018]优选地，碱基编辑系统包括融合蛋白；所述融合蛋白由dLbCpf1的对应蛋白和腺嘌呤脱氨酶ABE8e组成；dLbCpf1蛋白变体的编码基因如序列表中SEQ ID NO：1所示；腺嘌呤脱氨酶ABE8e的编码基因如序列表中SEQ ID NO：2所示。
[0019]另一方面，本专利技术提供一种用于所述的水稻碱基编辑系统的重组表达载体，其特征在于，所述重组表达载体包括表达盒一和表达盒二；所述表达盒一表达上述的融合蛋白；所述表达盒二表达上述的crRNA和目标靶点序列。
[0020]另一方面，本专利技术提供一种所述的水稻碱基编辑系统的应用，所述应用包括利用所述碱基编辑系统中的dLbCpf1的编码基因、crRNA的DNA分子、腺嘌呤脱氨酶ABE8e的编码基因，以将其分别导入目标受体内，使所述dLbCpf1、所述crRNA和所述ABE8e的编码基因均得到表达，提高水稻基因组上为TTTV的PAM序列附近的A:T突变成G:C的定点替换效率，获得含有突变位点的转基因植物或植物部分。
[0021]另一方面，本专利技术提供一种所述的重组表达载体的应用，其特征在于：所述应用包括利用所述的重组表达载体中的dLbCpf1的编码基因、crRNA的DNA分子、腺嘌呤脱氨酶ABE8e的编码基因，以将其分别导入目标受体内，使所述dLbCpf1、所述crRNA和所述ABE8e的编码基因均得到表达，提高水稻基因组上为TTTV的PAM序列附近的A:T突变成G:C的定点替换效率，获得含有突变位点的转基因植物或植物部分。
[0022]优选地：所述受体可为植物愈伤组织。
[0023]优选地，“导入受体”的过程可经过侵染、共培养、筛选步骤来实现，进而得到编辑后的植物愈伤组织，然后利用愈伤组织分化成植株。
[0024]本专利技术将dLbCpf1的编码基因、crRNA的DNA分子、腺嘌呤脱氨酶ABE8e的编码基因导入生物体或生物细胞内，使所述dLbCpf1、所述crRNA和所述ABE8e的编码基因均得到表达，实现基因组靶点序列的编辑。
[0025]所述PAM序列为与所述靶点序列3
′
端相连的一段DNA序列。所述PAM序列中的N与所述靶点序列3
′
端相连。
[0026]优选地，所述的dLbCpf1蛋白变体的对应基因由序列表中S本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种基于LbCpf1变体的水稻碱基编辑系统，其特征在于，所述水稻碱基编辑系统包含所述LbCpf1变体，所述LbCpf1变体为dLbCpf1，其如序列表SEQ ID NO：1所示。2.根据权利要求所述的水稻碱基编辑系统，其特征在于，所述水稻碱基编辑系统包括所述LbCpf1变体、crRNA、和腺嘌呤脱氨酶ABE8e；所述腺嘌呤脱氨酶ABE8e基因如序列表中SEQ ID NO：2所示。3.一种LbCpf1变体，其特征在于，所述LbCpf1变体的序列如序列表SEQ ID NO：1所示。4.一种基于LbCpf1变体的重组表达载体，其特征在于，所述重组表达载体包括表达盒一和表达盒二；所述表达盒一表达权利要求3中所述LbCpf1变体；所述表达盒二表达所述crRNA和目标靶点序列，其中所述融合蛋白的结构为：P1
‑
A1
‑
B
‑
C
‑
D
‑
A2
‑
E式中，P1为第一启动子；A1、A2为无或核定位信号序列NLS；B为腺嘌呤脱氨酶ABE8e基因序列；C为任意的连接肽或连接序列；D为dLbCpf1基因序列；E为第一终止子；所述的第二表达盒为crRNA表达盒，在所述crRNA表达盒中含有对应于crRNA的编码序列；并且所述第二表达盒具有结构：P2
‑
G
‑
H
‑
T式中，P2为第二启动子；G为对应于直接重复序列(direct repeat,DR)H为目标位点引导序列sg；T为无或终止序列。5.一种用于碱基编辑系统的重组表达载体，其特征在于，所述重组表达载体包括表达盒一和表达盒二。6.一种基于LbCpf1变体的水稻碱基编辑系统的应用，其特征在于：所述应用包括利用权利要求4所述的重组表达载体中的dLbCpf1的编码基因、腺嘌呤脱氨酶ABE8e的编码基因、crRNA的DNA...

【专利技术属性】
技术研发人员：魏鹏程，陈俐克，徐斐，刘小双，蒋迎利，丁健，王欢欢，
申请(专利权)人：安徽农业大学，
类型：发明
国别省市：