【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于动物基因工程和基因遗传修饰领域，具体地说，涉及一种angptl3基因人源化的非人动物及其构建方法和在生物医药领域的应用。
技术介绍
1、angptl3是血管生成素样蛋白家族中的一员，其主要在肝脏表达，是含有460个氨基酸的多肽。angptl3有两个区域，即n末端卷曲螺旋结构域和c末端纤维蛋白原区域，n端区域在抑制脂蛋白脂肪酶活性中起关键作用，该酶可降解肌肉和脂肪组织毛细血管中的循环甘油三酯，其抑制会导致高甘油三酯血症，从而引发动脉粥样硬化斑块的形成。c端结构域在甘油三酯(tgs)的代谢中没有直接作用。
2、据报道，携带angptl3功能丧失突变的个体总血浆低密度脂蛋白胆固醇(ldl-c)、血浆高密度脂蛋白胆固醇(hdl-c)和血浆甘油三酯浓度明显低于未携带这些突变的个体，从而导致心血管风险显著降低。angptl3除了对脂质代谢有影响，也发现其具有促炎和促血管生成作用，这意味着在动脉粥样硬化的发病机制中具有额外的作用。
3、迄今为止，抗人angptl3全人单克隆抗体evinacumab在临床前试验和健康志愿者和纯合子家族性高胆固醇血症患者的临床试验中均证实对血脂有积极作用，而且，对现有疗法产生耐药性的患者也有很大的治疗潜力。
4、随着基因工程技术的不断发展和成熟，用人类基因替代或置换动物的同源性基因已经实现，通过这种方式开发人源化实验动物模型是动物模型未来的发展方向。其中基因人源化动物模型，即利用基因编辑技术，用人源正常或突变基因替换动物基因组的同源基因，可建立更接近人类生理或疾病
5、鉴于angptl3的作用机制，以及在降血脂治疗领域的巨大应用价值，为进一步探索其相关生物学特性，提高临床前期药效试验的有效性，提高研发成功率，使临床前期的试验更有效并使研发失败最小化，本领域急需开发angptl3相关信号通路的非人动物模型。此外，本方法得到的非人动物还可与其它基因人源化非人动物交配得到多基因人源化动物模型，用于筛选和评估针对该信号通路的人用药及联合用药的药效研究。本专利技术在学术和临床研究中具有广阔的应用前景。
技术实现思路
1、本申请构建的angptl3基因人源化的非人动物具有重要应用价值，如何改进和提升细胞或组织移植，更重要的是，由于人类基因片段的插入，动物体内可表达或部分表达人的angptl3蛋白，可作为仅能识别人angptl3蛋白序列的药物的靶点，为在动物水平进行抗人抗体及其它药物的筛选提供了可能。
2、本专利技术的第一方面，提供了一种angptl3基因人源化的非人动物，所述的非人动物体内表达人或人源化angptl3蛋白，和/或，所述的非人动物的基因组中包含人angptl3基因的部分或人源化angptl3基因。
3、优选的，所述的人源化angptl3蛋白包含人angptl3蛋白的部分，所述的人angptl3蛋白的部分包含人angptl3蛋白至少50个连续氨基酸，例如至少50、100、150、200、250、300、350、400、450、455、456、457、458、459、460个连续氨基酸；优选包含seq id no：2所示氨基酸序列；或者，包含与seq id no：2所示氨基酸序列同一性至少为80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％的氨基酸序列。
4、在本专利技术的一个具体实施方式中，所述的人源化angptl3蛋白的氨基酸序列包含下列任一种：
5、a)seq id no：2所示氨基酸序列；
6、b)与seq id no：2所示氨基酸序列同一性至少为80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％的氨基酸序列；
7、c)与seq id no：2所示氨基酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个氨基酸的氨基酸序列；或，
8、d)与seq id no：2所示氨基酸序列所示的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个氨基酸残基的氨基酸序列。
9、优选的，所述的人源化angptl3基因包含人angptl3基因的部分，或者，包含编码人angptl3蛋白的全部或部分核苷酸序列。
10、优选的，所述的非人动物的基因组中包含编码人angptl3蛋白的全部或部分核苷酸序列。
11、优选的，所述的人angptl3基因的部分可以为人angptl3基因的基因组dna序列、cds或cdna序列。
12、优选的，所述的人angptl3基因的部分包含人angptl3基因的1号至7号外显子的全部或部分。进一步优选的，包含人angptl3基因的1号至7号外显子中的任一个或两个以上的外显子的组合。
13、优选的，所述的人angptl3基因的部分包含人angptl3基因1号外显子的全部或部分、2号至6号外显子的全部和7号外显子的全部或部分，进一步优选还包含1-2号内含子和/或6-7号内含子。
14、优选的，所述的人angptl3基因的部分包含人angptl3基因1号外显子的全部或部分、2号外显子的全部、3号外显子的全部、4号外显子的全部、5号外显子的全部、6号外显子的全部和7号外显子的全部或部分。
15、其中，1号外显子的部分包含至少100bp连续核苷酸序列，例如至少100、150、200、250、300、350、400、450、493、494、495、496、497、500、542bp连续核苷酸序列，优选包含1号外显子中编码区的核苷酸序列；7号外显子的部分至少50bp连续核苷酸序列，例如至少50、100、150、182、183、184、185、186、187、188、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、1500、1600、1681bp连续核苷酸序列，优选包含7号外显子中编码区的核苷酸序列。
16、优选的，还包含7号外显子下游至少100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、1050、1051、1052、1053、1054、1055、1056、1057、1058、1059、1060、1070、1100、1200连续核苷酸序列。
17、再优选的，所述的人angptl3基因的部分包含人angptl3基因的起始密码子至终止密码子的基因组dna序列、cds序列或cdna序列。
18、优选的，所述的人angptl3基因的部分的核苷酸序列包含下列任一种：
19、a)seq id no：84、seq id no：59、seq id no：10、seq id no：9或seq id no：9的第19本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种ANGPTL3基因人源化的非人动物的构建方法，其特征在于，所述的非人动物体内表达人或人源化ANGPTL3蛋白，和/或，所述的非人动物的基因组中包含人ANGPTL3基因或人源化ANGPTL3基因；优选的，所述的非人动物的内源ANGPTL3蛋白表达降低或缺失。
2.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述人或人源化ANGPTL3蛋白包含人ANGPTL3基因的1号至7号外显子的全部或部分编码的氨基酸序列。
3.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述构建方法包括将编码人ANGPTL3蛋白的核苷酸序列导入非人动物内源基因座。
4.根据权利要求3所述的构建方法，其特征在于，所述导入为插入或替换；
5.根据权利要求3-4任一所述的构建方法，其特征在于，所述编码人ANGPTL3蛋白的核苷酸序列为人ANGPTL3的基因组DNA序列、CDS序列或cDNA序列。
6.根据权利要求3-5任一所述的构建方法，其特征在于，所述导入为插入，优选的，所述导入非人动物内源基因座为插入非人动物ANGPTL3基因的1号外显子、Hipp1
7.根据权利要求1-6任一所述的构建方法，其特征在于，所述人ANGPTL3基因或人源化ANGPTL3基因通过内源调控元件或外源调控元件进行调控，优选的，所述外源调控元件为人ANGPTL3启动子或Alb启动子/增强子。
8.根据权利要求1-7任一所述的构建方法，其特征在于，所述编码人ANGPTL3蛋白的核苷酸序列编码的氨基酸序列与SEQ ID NO：2所示氨基酸序列同一性至少为70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％。
9.根据权利要求1-8任一所述的构建方法，其特征在于，所述编码人ANGPTL3蛋白的核苷酸序列与SEQ ID NO：9、10、59或84至少70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％，优选的，所述编码人ANGPTL3蛋白的核苷酸序列为SEQ ID NO：9、10、59或84。
10.根据权利要求1-9任一所述的构建方法，其特征在于，所述的构建方法还包括将ANGPTL3基因人源化的非人动物与其他基因修饰的非人动物交配、体外授精或直接进行基因编辑，并进行筛选，得到多基因修饰的非人动物；
11.根据权利要求1-10任一所述的构建方法，其特征在于，人或人源化ANGPTL3基因和/或其他基因对于内源被修饰的基因座为纯合或杂合。
12.根据权利要求1-11任一所述的构建方法，其特征在于，所述的非人动物为大鼠或小鼠。
13.一种人源化ANGPTL3基因，其特征在于，所述的人源化ANGPTL3基因包含人ANGPTL3基因的全部或部分，优选包含人ANGPTL3基因的1号至7号外显子的全部或部分。
14.根据权利要求14所述的人源化ANGPTL3基因，其特征在于，所述的人源化ANGPTL3基因转录的mRNA序列包含下列组中的任一种：
15.一种细胞、组织或器官，其特征在于，所述的细胞、组织或器官的基因组中包含权利要求13或14所述的人源化ANGPTL3基因，或者，权利要求1-12任一所述的构建方法获得的非人动物。
16.一种权利要求1-12任一所述的构建方法获得的非人动物，或，权利要求13或14所述的人源化ANGPTL3基因，或权利要求15所述的细胞、组织或器官的应用，其特征在于，所述的应用包含：
...【技术特征摘要】
1.一种angptl3基因人源化的非人动物的构建方法，其特征在于，所述的非人动物体内表达人或人源化angptl3蛋白，和/或，所述的非人动物的基因组中包含人angptl3基因或人源化angptl3基因；优选的，所述的非人动物的内源angptl3蛋白表达降低或缺失。
2.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述人或人源化angptl3蛋白包含人angptl3基因的1号至7号外显子的全部或部分编码的氨基酸序列。
3.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述构建方法包括将编码人angptl3蛋白的核苷酸序列导入非人动物内源基因座。
4.根据权利要求3所述的构建方法，其特征在于，所述导入为插入或替换；
5.根据权利要求3-4任一所述的构建方法，其特征在于，所述编码人angptl3蛋白的核苷酸序列为人angptl3的基因组dna序列、cds序列或cdna序列。
6.根据权利要求3-5任一所述的构建方法，其特征在于，所述导入为插入，优选的，所述导入非人动物内源基因座为插入非人动物angptl3基因的1号外显子、hipp11位点或rosa26位点；
7.根据权利要求1-6任一所述的构建方法，其特征在于，所述人angptl3基因或人源化angptl3基因通过内源调控元件或外源调控元件进行调控，优选的，所述外源调控元件为人angptl3启动子或alb启动子/增强子。
8.根据权利要求1-7任一所述的构建方法，其特征在于，所述编码人angptl3蛋白的核苷酸序列编码的氨基酸序列与seq id no：2所示氨基酸序列同一性至少为70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％。
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【专利技术属性】
技术研发人员：张淑金，董云霞，周小飞，沈志远，苏晓晔，王凌宇，
申请(专利权)人：百奥赛图江苏基因生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：
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