携带基因元件组合的载体组件、受体细胞文库、制备和筛选方法及用途技术

本发明专利技术提供了携带基因元件组合的载体组件、受体细胞文库、制备和筛选方法及用途，该受体细胞文库由细胞和载体组件融合而成，载体组件至少携带三个基因元件，分别为编码一个或多种独特型synNotch受体的多种第一基因元件；载有一种或多种基因回路的第二基因元件；编码一种或多种独特型嵌合抗原受体的第三基因元件。其中，当第一基因元件编码一种独特型synNotch受体时，第三基因元件必须编码至少三种独特型嵌合抗原受体，当第三基因元件编码一种独特型嵌合抗原受体时，第一基因元件必须编码三种独特型synNotch受体。基因回路是预编程性的，将调节性顺势作用因子与转录因子组合，在第一基因元件编码的synNotch受体活化时，对第三基因元件编码的嵌合抗原受体进行控制性表达。

Carrier component, receptor cell library, preparation, screening method and application of gene element combination

【技术实现步骤摘要】
携带基因元件组合的载体组件、受体细胞文库、制备和筛选方法及用途
本专利技术涉及生物医药工程技术和合成生物学领域，具体涉及一种基因元件组合和携带该组合的synNotch受体及人工受体细胞文库，并对该基因元件组合、细胞文库的制备构建方法、针对体内抗原和/或体外抗原的筛选方法、细胞文库的用途进行了详细说明。
技术介绍
对于以恶性肿瘤为代表的人类重大疾病，其特点在于恶性肿瘤具有高度的变异性、个体差异、异质性、进化性。特异性的肿瘤抗原鉴定困难、多样性广、个体化差异极大，且恶性肿瘤组织可以随着病情发展和治疗手段压力进行生物进化，具有较大的变异度。噬菌体展示技术等文库技术可以利用分子生物学和基因工程方法在体外构建肽文库，然后进行筛选。在筛选方式上，一般采用体外筛选或体内筛选的方法。体外筛选最为常用，如将特定抗原偶联到固相支持物(磁珠或酶联板)上，加入噬菌体肽库或其他抗体文库进行洗脱、富集筛选的步骤。但事实上，一旦离体，无论使用何种抗原(如细胞、组织等)，都因为脱离体内环境而造成抗原变化和丢失。在体内筛选方式上也有一些公开报道，如为了得到能特异结合活体组织、器官并在体内具有稳定性好、特异性高的小肽，以Ruoslahti、Pasqualini和Arap为主的研究小组于1996年创新性的首次将噬菌体肽库直接注射到小鼠体内进行筛选，得到了与小鼠肾、脑血管结合的小肽等[Pasqualini等.Nature，1996，380(6572)：364—366]。但是噬菌体等在体内容易被巨噬细胞、上皮细胞等抗原递呈细胞吞噬，造成噬菌体的损失。专利文献CN109576292A公开了利用合成Notch受体(synNotch受体)细胞作为载体的抗体文库及针对体外固相抗原的筛选方法。与噬菌体展示等传统技术相比，synNotch受体文库结合已知或未知抗原后，在细胞内发生激活反应，使细胞可以产生荧光蛋白或分子标签、自杀蛋白等人工标志物，进而可以根据人工标志物的表达分离携带活化synNotch受体的细胞。通过该过程可以得到结合某种已知或未知抗原的synNotch受体，并可进一步利用synNotch受体获得抗体。但通过这样的筛选方法获得的抗体能否用于疾病治疗未知，如并不知道该抗体能否产生如杀伤肿瘤细胞、改善疾病症状等药效学作用，仍需进一步验证。而噬菌体展示等抗体库技术通过淘选也可以获得已知或未知抗原具有结合能力的抗体，但无法确定这些有结合能力的抗体是否用于疾病治疗。因此，该系统和噬菌体展示等传统系统对比，在功能上并无提高，其并不能提高现有技术对抗体等功能分子用于产品制备的效益。由此可知，利用该专利公开的方法中仅能筛选出人工受体或抗体，这些人工受体或抗体能结合特定的抗原或者特定的疾病组织，但能否应用于治疗产品的价值并不清楚，后续需要大量的药效学工作和验证性工作，难以实现作为制备治疗药物、试剂、试剂盒的用途。另一方面更难以实现针对变化性的、进化性的抗原进行捕捉，本质上和噬菌体抗体展示等展示方法并无质的区别。专利文献WO2015/123642是本专利技术的一个
技术介绍
，该专利公开了嵌合抗原受体文库的构建制备方法，提出了制备大量CAR形成文库、以及进一步携带CAR文库的细胞文库的方法。而该专利文献虽然描述了利用通用技术进行CAR文库进一步筛选方法，如使用iQueTM筛选器(Intellicyt,Albuquerque,NM)(一种高通量流式细胞仪)进行个别CAR分子的高通量测试，但该文献仅仅公开了多个CAR的制备方案，CAR细胞文库的筛选方向不能跟随抗原的变化而变化，在筛选潜能上没有提高缺乏效率。另一方面，虽然同为人工受体，CAR受体本身的激活精度上远远低于synNotch受体，不利于基因回路的设计。综上可知，本领域迫切需要建立一种克服上述缺陷的全新技术。有鉴于此，特提出本专利技术。
技术实现思路
本专利技术依托上述研究背景，提供了一种含有新的基因元件的synNotch受体及嵌合抗原受体组合式细胞文库，并对该基因元件组合、细胞文库的制备构建方法、针对体内抗原和/或体外抗原的筛选方法、细胞文库的用途进行了详细说明。本专利技术的第一方面，提供了一种载体组件。其携带三种基因元件，分别为：(1)编码一种或多种独特型synNotch受体的多种第一基因元件(即synNotch受体文库)；(2)载有一种或多种独特型基因回路的第二基因元件；(3)编码一种或多种独特型嵌合抗原受体的第三基因元件。其中，当第一基因元件编码一种独特型synNotch受体时，第三基因元件必须编码至少三种独特型嵌合抗原受体，当第三基因元件编码一种独特型嵌合抗原受体时，第一基因元件必须编码三种独特型synNotch受体，以实现筛选。基因回路是预编程性的，为调节性顺势作用因子与转录因子的组合，在第一基因元件编码的synNotch受体活化时，对第三基因元件所编码的嵌合抗原受体进行控制性表达。synNotch受体包含细胞间信号传导受体Notch的核心调节结构域、合成性的胞外识别结构域和合成性的胞内转录结构域，所述嵌合抗原受体包括细胞内信号传导结构域、跨膜结构域和细胞外识别结构域。两种受体的细胞外识别结构域均包括完整的抗体、组成抗体的重链、轻链或抗体片段。本专利技术中，所述的“独特型”synNotch受体和嵌合抗原受体均是就它们的胞外识别结构域而言的。当然，专利技术并不限制于胞外识别结构域。本专利技术中的基因元件组合可以实现如下功能：当第一基因元件编码的synNotch受体活化时，可以通过第二基因元件预编程的基因回路实现同时对第三基因元件的控制性表达。所述控制性表达包括激活转录表达、增强转录表达、终止转录表达、抑制转录表达中的任意一种或至少两种的组合。进一步，本专利技术中的基因元件组合还包括：(4)编码一种或多种独特型筛选标记蛋白的第四基因元件。此时，基因元件组合可以实现的功能为：当第一基因元件编码的synNotch受体活化时，可以通过第二基因元件预编程的基因回路实现同时对第三基因元件和第四基因元件的控制性表达。其中，该第四基因元件中的筛选标记蛋白包括药物抗性蛋白、自杀蛋白、荧光蛋白基因或分子标签蛋白中的任意一种或至少两种的组合。第一基因元件中，术语“synNotch受体”是合成生物学概念。synNotch受体包含了天然的细胞间信号传导受体Notch的核心调节结构域，同时含有合成性的胞外识别结构域和合成性的胞内转录结构域。合成性的胞外识别结构域可以构建为如单链抗体，当单链抗体识别并结合抗原时，synNotch系统发生诱导性跨膜区域剪切，从而释放胞内转录结构域进入细胞核，结合上游顺式激活子来激活受调控目标基因的表达。由于Notch基因的保守性，可以利用多种物种的Notch进行构建，如专利CN109180805A所述了人，鼠，斑马鱼，果蝇等Notch基因来源的Notch受体。专利CN109576292A公开了胞外识别结构域为随机化而产生synNotch受体文库的方法。在本专利技术中，如提到蛋白质结构域和多肽，如抗原结合结构域、铰链结构域、跨本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种载体组件，其特征在于，包括一个或多个载体，以及插入在所述载体上的三种基因元件，该三种基因元件分别为编码一种或多种独特型synNotch受体的多种第一基因元件；载有一种或多种基因回路的第二基因元件；编码一种或多种独特型嵌合抗原受体的第三基因元件，/n其中，当所述第一基因元件编码一种独特型synNotch受体时，所述第三基因元件必须编码至少三种独特型嵌合抗原受体，当所述第三基因元件编码一种独特型嵌合抗原受体时，第一基因元件必须编码三种独特型synNotch受体；/n所述基因回路是预编程性的，为调节性顺势作用因子与转录因子的组合，在所述第一基因元件编码的synNotch受体活化时，对所述第三基因元件所编码的嵌合抗原受体产生表达调控效应；/nsynNotch受体包含细胞间信号传导受体Notch的核心调节结构域、合成性的胞外识别结构域和合成性的胞内转录结构域，所述嵌合抗原受体包括细胞内信号传导结构域、跨膜结构域和细胞外识别结构域，/nsynNotch受体和嵌合抗原受体的细胞外识别结构域均包括完整的抗体、组成抗体的重链、轻链或抗体片段。/n

【技术特征摘要】
1.一种载体组件，其特征在于，包括一个或多个载体，以及插入在所述载体上的三种基因元件，该三种基因元件分别为编码一种或多种独特型synNotch受体的多种第一基因元件；载有一种或多种基因回路的第二基因元件；编码一种或多种独特型嵌合抗原受体的第三基因元件，
其中，当所述第一基因元件编码一种独特型synNotch受体时，所述第三基因元件必须编码至少三种独特型嵌合抗原受体，当所述第三基因元件编码一种独特型嵌合抗原受体时，第一基因元件必须编码三种独特型synNotch受体；
所述基因回路是预编程性的，为调节性顺势作用因子与转录因子的组合，在所述第一基因元件编码的synNotch受体活化时，对所述第三基因元件所编码的嵌合抗原受体产生表达调控效应；
synNotch受体包含细胞间信号传导受体Notch的核心调节结构域、合成性的胞外识别结构域和合成性的胞内转录结构域，所述嵌合抗原受体包括细胞内信号传导结构域、跨膜结构域和细胞外识别结构域，
synNotch受体和嵌合抗原受体的细胞外识别结构域均包括完整的抗体、组成抗体的重链、轻链或抗体片段。


2.根据权利要求1所述的载体组件，其特征在于，还包括编码一种或多种筛选标记蛋白的第四基因元件，
所述筛选标记蛋白包括药物抗性蛋白、自杀蛋白、荧光蛋白基因或分子标签蛋白中的任意一种或至少两种的组合，
当所述第一基因元件编码的synNotch受体活化时，通过第二基因元件预编程的基因回路实现同时对第三基因元件和第四基因元件产生表达调控效应。


3.根据权利要求1或2所述的载体组件，其特征在于：
其中，所述抗体片段包括抗体可变区、单链抗体、单域抗体或Fab段；
Notch核心调节结构域来源于人Notch基因、小鼠Notch基因、大鼠Notch基因、斑马鱼Notch基因或果蝇Notch基因，
合成性的胞内转录结构域包括TetR-VP64、Gal4-VP64、PIP-VP64、ZF21-16-VP64、ZF-42-10-VP64、ZF43-8-VP64、ZF54-8-VP64、ZFHD1-VP64、Gal4-KRAB、TetR-KRAB、PIP-KRAB、ZF21-16-KRAB、ZF-42-10-KRAB、ZF43-8-KRAB、ZF54-8-KRAB、ZFHD1-KRAB中的任意一种或至少两种的组合，
所述调节性顺势作用因子包括单个顺势作用因子和融合式顺势作用因子，融合式顺势作用因子包括一种或多种单个顺势作用因子的灵活组合，
所述单个顺势作用因子包括NFAT反应启动子元件、NFκB反应启动子元件、四环素反应元件、半乳糖代谢酶系基因启动子的UAS、PIP反应元件、ZFHD1反应元件、ZF21-16反应元件、ZF42-10反应元件、ZF43-8反应元件、ZF54-8反应元件、最小化CMV启动子、CMV启动子、SV40启动子、最小化IL-2启动子、最小化昆虫热休克蛋白70启动子、最小化HIVtata启动子中的任意一种或至少两种的组合；
所述融合式顺势作用因子包括4×NFAT、6×NFAT、5×NFκB、10×NFκB、7×TRE-PCMV-min、5×UAS-PCMV-min、4×PIR-PCMV-min、8×PIR-PCMV-min、8×PIR-Phsp70min、4×ZFHD1RE-PCMV-min、8×ZF21-16RE-PCMV-min、8×ZF42-10RE-PCMV-min、8×ZZF43-8R-PCMV-min、8×ZF54-8RE-PCMV-min、7×TRE-PSV40、7×TRE-Pcmv、5×UAS-PSV40、4×PIR-PSV40、8×PIR-PSV40、4×ZFHD1RE-PSV40、8×ZF21-16RE-PSV40、8×ZF42-10RE-PSV...

【专利技术属性】
技术研发人员：傅文燕，胡适，
申请(专利权)人：沣潮医药科技上海有限公司，
类型：发明
国别省市：上海;31