本发明专利技术提供了一种RANKL重组蛋白表达载体的构建方法，其特征在于，包括以下过程：(1)体外分子克隆技术，获得小鼠RANKL基因全长；(2)通过测序，明确已获得克隆序列与数据库中的序列完全一致；进一步通过基因重组技术将小鼠RANKL基因重组于pET‑32a表达载体中，成功构建RANKL重组蛋白表达载体。本发明专利技术还提供一种RANKL重组蛋白表达载体在制备治疗骨代谢异常相关疾病方面的应用。其中，所述骨代谢异常相关疾病包括骨硬化症及尖周肉牙肿病。本发明专利技术中的RANKL重组蛋白表达载体，可以通过在体外诱导表达大量RANKL重组蛋白，最后通过RANKL重组蛋白促进破骨细胞的分化及骨吸收功能，从而治疗和改善骨硬化症及尖周肉牙肿病。
Construction and application of a RANKL recombinant protein expression vector
【技术实现步骤摘要】
一种RANKL重组蛋白表达载体的构建方法及其应用
本专利技术属于生物医药
，具体涉及一种RANKL重组蛋白表达载体的构建方法及其应用。
技术介绍
目前，对于骨硬化症及尖周肉牙肿的治疗治疗主要局限于传统药物或显微外科手术，但常染色体异常引起的骨硬化症严重的病人中无法取得较好的效果，主要是由于骨代谢过程中破骨细胞的功能异常引起的；在目前的研究中表明RANKL在调控破骨细胞分化及活化具有重要作用；而骨代谢疾病的发生大多与成骨细胞介导的骨形成及破骨细胞介导的骨吸收密切相关，但是，如何构建RANKL尚未明确。
技术实现思路
本专利技术目的在于针对现有技术的缺陷和不足，提供一种RANKL重组蛋白表达载体的构建方法及其应用。为解决上述技术问题，本专利技术的实施例提供一种RANKL重组蛋白表达载体的构建方法，其特征在于，包括以下过程：(1)体外分子克隆技术，获得小鼠RANKL基因全长；(2)通过测序，明确已获得克隆序列与数据库中的序列完全一致；进一步通过基因重组技术将小鼠RANKL基因重组于pET-32a表达载体中，成功构建RANKL重组蛋白表达载体。进一步的，所述步骤(1)中体外分子克隆技术，获得小鼠RANKL基因全长，具体包括以下过程：(1-1)小鼠头盖骨样本RNA提取及RT-PCR；(1-1-1)分离出生后1-3天内的小鼠头盖骨组织，通过TRIZOL进行组织RNA的提取；将分离到的头盖骨组织转移至1.5mlRNase-freeEP管中，加入1mlTrizol裂解液，使用匀浆器将制成组织悬液后置于冰上裂解10min；(1-1-2)加入200μl三氯甲烷，置于涡旋仪剧烈振荡15s，室温静置5min后12000rpm离心15min；离心温度均为4℃；(1-1-3)小心取出离心管，此时可见管内液体分为3层，小心吸取无色上清至新EP管中，再加入异丙醇500μl，上下轻柔颠倒混匀，静置10min后12000rpm离心10min；(1-1-4)弃去上清，用1ml75％乙醇将RNA沉淀清洗一遍，12000rpm离心5min；(1-1-5)弃去上清，静置待剩余酒精挥发；(1-1-6)用RNase-free水溶解RNA；测定并记录RNA的浓度与OD值，做好标记储存在-80℃中；(1-2)RNA逆转录合成cDNA：使用TakaraRR047A逆转录试剂盒进行RT-PCR反应，将500ngRNA逆转成cDNA；(1-2-1)去除基因组体系如下：(1-2-2)冰上配制并混和去基因组体系各组分后，于PCR仪上42℃2min，4℃放置；逆转录体系如下：(1-2-3)冰上配制好逆转反应体系；再混匀去基因组体系，于PCR仪上37℃30min，85℃5s，4℃∞，最终得到的产物用RNase-free水稀释10倍作为RT-PCR反应模板备用；(1-2-4)设计引物克隆mRNAKL基因上游引物：NcoI-CCATGG–CTCCAGCTATGATGGAAGGCTC；下游引物：XhoI-CTCGAG–TCAGTCTATGTCCTGAACTTTGAAAG；冰上配制好PCR反应体系如下：(1-2-5)PCR反应结束后，通过琼脂糖凝胶电泳分理处目的片段，目的片段大小应该在525bp范围；通过胶回收试剂盒回收扩增出的产物片段；(1-2-6)产物进行末尾加A反应，反应体系如下：加A产物与T载体连接，反应体系如下：(1-2-7)连接产物进行转化：(1-2-7-1)取10ul上述连接好的质粒，按照9:1加入solutionIII，轻轻混匀后，加入100ulDH5a感受态细胞中，轻轻谈匀，4℃冰浴30min，42℃热激90s，4℃冰浴5min，加入450ulLB培养基，150rpm，37℃,45min；同时，制备蓝白斑筛选平板，取10ulIPTG，40ulX-gal及30ulAmp均匀涂布与LB固体平板上备用；(1-2-7-2)摇菌结束后3000rpm离心5min，弃上清，重悬于100ulLB培养基中，均匀涂布于含有Amp+(30ul)，IPTG(10ul)及X-gal(40ul)平板中，37℃过夜培养；(1-2-7-3)通过蓝白斑筛选，挑取白色单克隆菌落进行摇菌扩增后送测序。进一步的，所述步骤(2)具体包括以下步骤：(2-1)pET-32a与rankl片段酶切(2-1-1)选择测序比对正确的进行质粒提取，同时，提取pET-32a表达载体质粒；(2-1-2)进行双酶切反应后，进行琼脂糖凝胶电泳，回收目的片段，与回收双酶切后的pET-32a表达载体，T4连接酶，16℃连接过夜，第二天转化DH5a，挑取单克隆菌落，小提质粒后进行双酶切，琼脂糖凝胶电泳鉴定；酶切反应体系如下：(2-1-3)酶切反应结束后，通过琼脂糖凝胶电泳分理出目的载体和目的基因，进行连接反应；(2-2)回收好的目的片段mRANKL与pET-32a载体连接反应体系(2-2-1)目的片段mRANKL与pET-32a载体，反应体系如下：(2-2-2)连接产物进行转化：(2-2-2-1)取10ul上述连接好的质粒，按照9:1加入solutionIII，轻轻混匀后，加入100ulDH5a感受态细胞中，轻轻谈匀，4℃冰浴30min，42℃热激90s，4℃冰浴5min，加入450ulLB培养基，150rpm，37℃,45min；摇菌结束后3000rpm离心5min，弃上清，重悬于100ulLB培养基中，均匀涂布于含有Amp+(30ul)平板中，37℃过夜培养；(2-2-2-2)挑取白色单克隆菌落进行摇菌扩增后进行质粒抽提，进行双酶切反应，通过琼脂糖凝胶电泳进行鉴定。本专利技术的实施例另外还提供一种RANKL重组蛋白表达载体在制备治疗骨代谢异常相关疾病方面药物的应用。进一步的，所述骨代谢异常相关疾病包括骨硬化症及尖周肉牙肿病。进一步的，所述药物中包含有促进破骨细胞的分化及活化的RANKL重组蛋白。本专利技术的上述技术方案的有益效果如下：(1)本专利技术表明了可以将小鼠RANKL基因重组与体外表达载体中，以大量获得小鼠RANKL重组蛋白，本专利技术提示了通过构建RANKL重组蛋白表达载体来获取大量RANKL重组蛋白，有潜力成为用于治疗和改善骨硬化症及尖周肉牙肿病新药物。(2)本专利技术是基于重组蛋白体外表达技术，通过构建RANKL重组蛋白体外表达载体为进一步治疗骨硬化症提供新思路和新药物。(3)本专利技术目前主要在构建及鉴定小鼠RANKL重组蛋白体外表达载体，后期将对重组蛋白进行表达和纯化，进一步在大动物及非人灵长类动物中研究其治疗骨硬化症的效果。附图说明为了更清楚地说明本专利技术实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种RANKL重组蛋白表达载体的构建方法，其特征在于，包括以下过程：(1)体外分子克隆技术，获得小鼠RANKL基因全长；(2)通过测序，明确已获得克隆序列与数据库中的序列完全一致；进一步通过基因重组技术将小鼠RANKL基因重组于pET-32a表达载体中，成功构建RANKL重组蛋白表达载体。/n
【技术特征摘要】
1.一种RANKL重组蛋白表达载体的构建方法，其特征在于，包括以下过程：(1)体外分子克隆技术，获得小鼠RANKL基因全长；(2)通过测序，明确已获得克隆序列与数据库中的序列完全一致；进一步通过基因重组技术将小鼠RANKL基因重组于pET-32a表达载体中，成功构建RANKL重组蛋白表达载体。
2.根据权利要求1所述的一种RANKL重组蛋白表达载体的构建方法，其特征在于，所述步骤(1)中体外分子克隆技术，获得小鼠RANKL基因全长，具体包括以下过程：
(1-1)小鼠头盖骨样本RNA提取及RT-PCR；
(1-1-1)分离出生后1-3天内的小鼠头盖骨组织，通过TRIZOL进行组织RNA的提取；将分离到的头盖骨组织转移至1.5mlRNase-freeEP管中，加入1mlTrizol裂解液，使用匀浆器将制成组织悬液后置于冰上裂解10min；
(1-1-2)加入200μl三氯甲烷，置于涡旋仪剧烈振荡15s，室温静置5min后12000rpm离心15min；离心温度均为4℃；
(1-1-3)小心取出离心管，此时可见管内液体分为3层，小心吸取无色上清至新EP管中，再加入异丙醇500μl，上下轻柔颠倒混匀，静置10min后12000rpm离心10min；
(1-1-4)弃去上清，用1ml75％乙醇将RNA沉淀清洗一遍，12000rpm离心5min；
(1-1-5)弃去上清，静置待剩余酒精挥发；
(1-1-6)用RNase-free水溶解RNA；测定并记录RNA的浓度与OD值，做好标记储存在-80℃中；
(1-2)RNA逆转录合成cDNA：使用TakaraRR047A逆转录试剂盒进行RT-PCR反应，将500ngRNA逆转成cDNA；
(1-2-1)去除基因组体系如下：
(1-2-2)冰上配制并混和去基因组体系各组分后，于PCR仪上42℃2min，4℃放置；逆转录体系如下：
(1-2-3)冰上配制好逆转反应体系；再混匀去基因组体系，于PCR仪上37℃30min，85℃5s，4℃∞，最终得到的产物用RNase-free水稀释10倍作为RT-PCR反应模板备用；
(1-2-4)设计引物克隆mRNAKL基因
上游引物：NcoI-CCATGG–CTCCAGCTATGATGGAAGGCTC；
下游引物：XhoI-CTCGAG–TCAGTCTATGTCCTGAACTTTGAAAG；
冰上配制好PCR反应体系如下：
(1-2-5)PCR反应结束后，通过琼脂糖凝胶电泳分理处目的片段，目的片段大小应该在525bp范围；通过胶回收试剂盒回收扩增出的产物片段；
(1-2-6)产物进行末尾加A反应，反应体系如下：
加A产物与T载体连接，反应体系如下：
(1-2-7...
【专利技术属性】
技术研发人员：王东，闵雯嫣，
申请(专利权)人：南通大学，
类型：发明
国别省市：江苏;32
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