一种高效表达外源蛋白的CHO细胞株的构建方法、构建的CHO细胞株及其应用技术

本发明专利技术提供了一种高效表达外源蛋白的CHO细胞构建方法，其中，该方法包括：克隆、重组一系列外源蛋白基因的表达质粒，该表达质粒分别逐一包含前置的13种信号肽及该外源蛋白基因；转染CHO细胞，根据表达量筛选出该外源蛋白表达量最高的前置信号肽序列，构建该信号肽序列和外源蛋白基因的表达质粒，然后转染CHO细胞，逐步筛选稳定表达外源蛋白的单克隆细胞。本发明专利技术还涉及该方法构建的高效表达外源蛋白的CHO细胞和使用该细胞表达外源蛋白的方法。本发明专利技术的方法能较常规表达显著提高蛋白表达含量，且可应用于多种外源蛋白的表达，无需对外源蛋白的基因进行优化，具有广泛的适用范围。

Construction method, construction and application of a CHO cell line with high expression of exogenous protein

【技术实现步骤摘要】
一种高效表达外源蛋白的CHO细胞株的构建方法、构建的CHO细胞株及其应用
本专利技术属于细胞系及其制备方法领域，特别涉及经引入外来遗传物质而修饰的细胞及其制备方法和应用。
技术介绍
CHO细胞是从成年雌性仓鼠卵巢中分离获得，为上皮贴壁细胞。该细胞具有不死性，可以传代百代以上，是目前生物工程上广泛使用的细胞。相对于其他的表达系统，它有如下优势：(1)具有准确的转录后修饰功能，表达的蛋白在分子结构、理化特性和生物学功能方面最接近于真核生物天然蛋白；(2)既可贴壁生长，又可悬浮培养，且耐受较高的剪切力和渗透压；(3)具有重组基因的高效扩增和表达能力；(4)具有产物胞外分泌功能，并且很少分泌自身的内源蛋白，便于下游产物的分离纯化。然而，如何提高CHO表达系统表达外源蛋白的表达量一直是国内外学者研究的方向，多数是针对具体外源基因进行特定改造来实现提高外源蛋白表达量，不适合其他的外源蛋白的高效表达，当应用到其他的外源蛋白时，需要对其他外源蛋白的基因重新进行改造，程序繁琐。因此，现实生产中需要一种适用于不同外源蛋白的，操作简单的高效表达方法。
技术实现思路
为解决上述问题，本专利技术提供一种高效表达外源蛋白的CHO细胞构建方法，其中，所述方法包括：步骤(1)克隆、重组一系列外源蛋白基因的表达质粒，所述表达质粒分别逐一包含前置的下列13种信号肽及所述外源蛋白基因，所述13种信号肽分别如SEQID.No.1、SEQID.No.2、SEQID.No.3、SEQID.No.4、SEQID.No.5、SEQID.No.6、SEQID.No.7、SEQID.No.8、SEQID.No.9、SEQID.No.10、SEQID.No.11、SEQID.No.12或SEQID.No.13所示；步骤(2)将所述步骤(1)构建的表达质粒转染CHO细胞，表达所述外源蛋白，检测其表达量，根据所述表达量筛选出所述外源蛋白表达量最高的前置信号肽序列；步骤(3)构建包含了以所述步骤(2)筛选出的信号肽作为前置信号肽和所述外源蛋白基因的表达质粒；步骤(4)将所述步骤(3)构建的表达质粒转染CHO细胞，使用嘌呤霉素和MTX筛选稳定表达外源蛋白的细胞；步骤(5)复苏所述步骤(4)筛选的所述稳定表达外源蛋白的细胞，大规模筛选其中表达量高的CHO细胞；步骤(6)将所述步骤(5)筛选的所述稳定、表达量高的CHO细胞进行单克隆细胞株筛选，选择稳定、高效表达外源蛋白的CHO单克隆细胞株；以及步骤(7)将所述步骤(6)筛选的所述稳定、高效表达外源蛋白的CHO单克隆细胞株连续传代，检测所述传代细胞的表达量，选择其中稳定性好、细胞生长特性好、蛋白产量高的CHO克隆株。本专利技术方法使得外源蛋白高效表达，能较CHO常规表达显著提高外源蛋白的表达量，且本专利技术方法可应用到多种外源蛋白的高效表达，可广泛适用于多种兽医疫苗蛋白，无需对外源蛋白的基因进行优化，具有广泛的适用范围。作为本专利技术的一种实施方式，本专利技术所述CHO细胞构建方法中，所述步骤(1)的表达质粒为pCAGGS；所述步骤(3)的表达质粒为pCAGGS。作为本专利技术的一种实施方式，本专利技术所述CHO细胞构建方法中，所述步骤(2)的CHO细胞为瞬时蛋白质表达的CHO细胞；所述步骤(2)的筛选先选出总表达量最高的5种CHO细胞，然后从所述5种CHO细胞中筛选出所述外源蛋白表达总量最高的CHO细胞，所述外源蛋白表达总量最高的CHO细胞转染质粒重组的信号肽为用于表达所述外源蛋白的信号肽。作为本专利技术的一种优选实施方式，本专利技术所述CHO细胞构建方法中，所述CHO细胞为ExpiCHO-S细胞。作为本专利技术的一种实施方式，本专利技术所述CHO细胞构建方法中，所述步骤(4)的CHO细胞为CHO-S细胞、CHOK1、或GSCHO细胞系；所述步骤(4)的筛选为将所述表达质粒线性化，转染所述CHO细胞，使用嘌呤霉素和MTX在递减的所述CHO细胞浓度梯度和递增的嘌呤霉素和MTX浓度梯度下分步筛选出稳定、高效表达外源蛋白的CHO细胞，然后复苏所述筛选的CHO细胞株。作为本专利技术的一种优选实施方式，本专利技术所述CHO细胞构建方法中，所述CHO细胞的梯度筛选工序为：离心所述CHO细胞，并重悬所述CHO细胞，接种两个T-150培养瓶，接种密度为5×105个活细胞/ml，在第1个T-150培养瓶中，加入嘌呤霉素至终浓度为10μg/ml，加入MTX至终浓度100nmol/L，在第2个T-150培养瓶中，加入嘌呤霉素至终浓度为20μg/ml，加入MTX至终浓度200nmol/L，然后将所述两个T-培养瓶置于37℃、含5％CO2的静置培养箱中孵育，待所述CHO细胞显示复苏迹象，将所述CHO细胞转移至125ml摇瓶中，接种密度为3×105个活细胞/ml，将所述CHO细胞置于37℃、含8％CO2的转速为130rpm的振荡摇床上孵育，每3-4天传代培养瓶中的CHO细胞，每次传代的接种密度为3×105个活细胞/ml，当细胞存活率超过85％，活细胞密度超过1×106个活细胞/ml时，完成药物筛选阶段1；所述筛选阶段1的每种细胞池分别接种2个新的125ml摇瓶，接种密度为4×105个活细胞/ml，在所述每种细胞池的第1个摇瓶中，加入嘌呤霉素至终浓度为30μg/ml，加入MTX至终浓度500nmol/L，在所述每种细胞池的第2个摇瓶中，加入嘌呤霉素至终浓度为50μg/ml，加入MTX至终浓度1000nmol/L，将所述CHO细胞置于37℃、含8％CO2的转速为130rpm的振荡摇床上孵育，每3-4天取样计数，待细胞显示复苏迹象，每3-4天传代培养瓶中的细胞，接种密度为3×105个活细胞/ml，当细胞存活率达到90％时，完成第2阶段筛选。作为本专利技术的一种更优选的实施方式，本专利技术所述CHO细胞构建方法中，所述复苏所述筛选的CHO细胞株工序为：复苏所述第2阶段获得的每种细胞池的细胞，待CHO细胞活率＞90％后，按照3×105个活细胞/ml的密度接种至含有30mlCDFortiCHO培养基的125ml摇瓶中，将所述CHO细胞置于37℃、含8％CO2的转速为130rpm的振荡摇床上进行孵育，定期取样，直至培养物活率降至50％以下，所述每次取样后在培养物中补充加入葡萄糖，对鉴定所述筛选的CHO细胞池单株细胞的表达产量进行大规模筛选，选择单株细胞表达量较高的5个细胞池。作为本专利技术的一种进一步优选的实施方式，本专利技术所述CHO细胞构建方法中，利用点杂交和WesternBlot大规模筛选鉴定所述筛选的CHO细胞池单株细胞的表达产量。作为本专利技术的一种进一步优选的实施方式，本专利技术所述CHO细胞构建方法中，在不含嘌呤霉素和MTX的选择培养基中复苏所述筛选出的5个细胞池的细胞，2-5天后待细胞活率达到＞90％时，经有限稀释，选取产量最高的15株CHO单克隆细胞。作为本专利技术的一种进一步优选的实施方式，本专利技术所述CHO细胞构建方法中，所述复苏15株高产率CHO克隆细胞至125ml摇瓶中，在37℃、含8％CO2的转速为130rpm的振荡摇床孵育，每3天传代1次，接种本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种高效表达外源蛋白的CHO细胞构建方法，其中，所述方法包括：/n步骤(1)克隆、重组一系列外源蛋白基因的表达质粒，所述表达质粒分别逐一包含前置的下列13种信号肽及所述外源蛋白基因，所述13种信号肽分别如SEQ ID.No.1、SEQID.No.2、SEQ ID.No.3、SEQ ID.No.4、SEQ ID.No.5、SEQ ID.No.6、SEQ ID.No.7、SEQID.No.8、SEQ ID.No.9、SEQ ID.No.10、SEQ ID.No.11、SEQ ID.No.12或SEQ ID.No.13所示；/n步骤(2)将所述步骤(1)构建的表达质粒转染CHO细胞，表达所述外源蛋白，检测其表达量，根据所述表达量筛选出所述外源蛋白表达量最高的前置信号肽序列；/n步骤(3)构建包含了以所述步骤(2)筛选出的信号肽作为前置信号肽和所述外源蛋白基因的表达质粒；/n步骤(4)将所述步骤(3)构建的表达质粒转染CHO细胞，使用嘌呤霉素和MTX筛选稳定表达外源蛋白的细胞；/n步骤(5)复苏所述步骤(4)筛选的所述稳定表达外源蛋白的细胞，大规模筛选其中表达量高的CHO细胞；/n步骤(6)将所述步骤(5)筛选的所述稳定、表达量高的CHO细胞进行单克隆细胞株筛选，选择稳定、高效表达外源蛋白的CHO单克隆细胞株；以及/n步骤(7)将所述步骤(6)筛选的所述稳定、高效表达外源蛋白的CHO单克隆细胞株连续传代，检测所述传代细胞的表达量，选择其中稳定性好、细胞生长特性好、蛋白产量高的CHO克隆株。/n...

【技术特征摘要】
1.一种高效表达外源蛋白的CHO细胞构建方法，其中，所述方法包括：
步骤(1)克隆、重组一系列外源蛋白基因的表达质粒，所述表达质粒分别逐一包含前置的下列13种信号肽及所述外源蛋白基因，所述13种信号肽分别如SEQID.No.1、SEQID.No.2、SEQID.No.3、SEQID.No.4、SEQID.No.5、SEQID.No.6、SEQID.No.7、SEQID.No.8、SEQID.No.9、SEQID.No.10、SEQID.No.11、SEQID.No.12或SEQID.No.13所示；
步骤(2)将所述步骤(1)构建的表达质粒转染CHO细胞，表达所述外源蛋白，检测其表达量，根据所述表达量筛选出所述外源蛋白表达量最高的前置信号肽序列；
步骤(3)构建包含了以所述步骤(2)筛选出的信号肽作为前置信号肽和所述外源蛋白基因的表达质粒；
步骤(4)将所述步骤(3)构建的表达质粒转染CHO细胞，使用嘌呤霉素和MTX筛选稳定表达外源蛋白的细胞；
步骤(5)复苏所述步骤(4)筛选的所述稳定表达外源蛋白的细胞，大规模筛选其中表达量高的CHO细胞；
步骤(6)将所述步骤(5)筛选的所述稳定、表达量高的CHO细胞进行单克隆细胞株筛选，选择稳定、高效表达外源蛋白的CHO单克隆细胞株；以及
步骤(7)将所述步骤(6)筛选的所述稳定、高效表达外源蛋白的CHO单克隆细胞株连续传代，检测所述传代细胞的表达量，选择其中稳定性好、细胞生长特性好、蛋白产量高的CHO克隆株。


2.根据权利要求1所述的方法，其中，所述步骤(1)的表达质粒为pCAGGS；所述步骤(3)的表达质粒为pCAGGS。


3.根据权利要求1所述的方法，其中，所述步骤(2)的CHO细胞为瞬时蛋白质表达的CHO细胞；优选地，所述CHO细胞为ExpiCHO-S细胞；
所述步骤(2)的筛选先选出总表达量最高的5种CHO细胞，然后从所述5种CHO细胞中筛选出所述外源蛋白表达总量最高的CHO细胞，所述外源蛋白表达总量最高的CHO细胞转染质粒重组的信号肽为用于表达所述外源蛋白的信号肽。


4.根据权利要求1所述的方法，其中，所述步骤(4)的CHO细胞为CHO-S细胞、CHOK1、或GSCHO细胞系；
所述步骤(4)的筛选为将所述表达质粒线性化，转染所述CHO细胞，使用嘌呤霉素和MTX在递减的所述CHO细胞浓度梯度和递增的嘌呤霉素和MTX浓度梯度下分步筛选出稳定、高效表达外源蛋白的CHO细胞，然后复苏所述筛选的CHO细胞株。


5.根据权利要求4所述的方法，其中，所述CHO细胞的梯度筛选工序为：离心所述CHO细胞，并重悬所述CHO细胞，接种两个T-150培养瓶，接种密度为5×105个活细胞/ml，在第1个T-150培养瓶中，加入嘌呤霉素至终浓度为10μg/ml，加入MTX至终浓度100nmol/L，在第2个T-150培养瓶中，加入嘌呤霉素至终浓度为20μg/ml，加入MT...

【专利技术属性】
技术研发人员：田克恭，谭菲菲，孙进忠，张许科，
申请(专利权)人：普莱柯生物工程股份有限公司，
类型：发明
国别省市：河南;41