人源化LAG-3基因改造动物模型的制备方法及应用技术

本发明专利技术涉及人源化基因的基因改造非人动物，特别是基因改造啮齿动物，但尤其是基因改造小鼠，具体涉及一种人源化LAG‑3基因改造动物模型的构建方法及其在生物医药领域的应用。

Preparation and application of human-derived LAG-3 gene modified animal model

【技术实现步骤摘要】
人源化LAG-3基因改造动物模型的制备方法及应用
本申请涉及人源化基因改造动物模型的建立方法及应用，具体而言，涉及基于一种人源化LAG-3基因改造动物模型的构建方法及其在生物医药方面的应用。
技术介绍
免疫疗法通过激活免疫系统攻击并杀死癌症细胞，是肿瘤研究的一个重要领域，近十年来已经应用在临床治疗中。研究表明，以T细胞的抑制性受体为目标进行治疗效果显著，是当前靶向基因治疗最成功的领域。其中，靶向CTLA-4和PD-1/PD-L1的单克隆抗体已经取得确切疗效，但病人的应答率较低，还不能充分满足临床需求，更多靶向其它的抑制性受体的新型药物正在或已经进入临床研究。淋巴细胞活化基因-3分子(lymphocyteactivationgene3，LAG-3)属于免疫球蛋白超家族，由胞外区、跨膜区和胞质区3个部分组成，是目前已经确定的T细胞抑制性受体之一。LAG-3主要表达在活化的T细胞、NK细胞和DC细胞上，通过与其配体组织相容性复合体Ⅱ类分子(majorhistocompatibilitycomplexclassⅡ，MHCⅡ)结合，负调控T细胞功能。已有证据表明，LAG-3在多种免疫应答类型中发挥了重要调控作用，特别是在肿瘤免疫中。LAG-3在多种血液系统肿瘤和实体肿瘤中异常表达，且与多项病理参数和预后密切相关。LAG-3抑制剂阻碍其信号通路，能增强特异性CD8+T细胞的抗肿瘤作用。此外，联合阻断LAG-3和PD-1可能是通过增加效应T细胞的比例起到减缓肿瘤生长的协同作用。可见抗LAG-3治疗联合其它多个信号分子，在临床上对改善肿瘤免疫治疗疗效具有应用价值，可能是今后研究的重要方向之一。实验动物疾病模型对于研究人类疾病发生的病因、发病机制、开发防治技术和药物是不可缺少的研究工具。目前与LAG-3相关的实验动物很少。ToruMiyazaki(1996)等人利用同源重组技术，将小鼠Lag-3基因上1-3号外显子用新霉素抗性基因替换，制备出Lag-3基因敲除小鼠。该小鼠NK细胞功能受损，对靶细胞的杀伤作用减弱或消失。进一步的研究证实该小鼠抗原特异性CD8+T细胞增殖增加；CD4+T细胞和CD8+T细胞的数量较野生型增加，但两者比值未观察到明显变化。此外，该小鼠制备过程中使用的胚胎干细胞(ES细胞)来源于129遗传背景的小鼠，得到嵌合鼠后需与C57BL/6进行多次回交。该方法缺陷在于：一般需要超过10代的回交才能获得纯合子，回交往往需要2年的时间，耗费时间、资金和科研精力；另一方面，回交次数不同也会造成试验结果重复性差。由于目前的模型小鼠存在上述缺陷，且不能用于抗人LAG-3抗体药物的动物体内药效检测与评价，考虑LAG-3基因在肿瘤免疫治疗领域具有巨大应用价值，为了使临床前期的试验更有效，本专利技术提供一种建立人源化LAG-3基因改造动物模型的新方法，并得到LAG-3基因人源化动物。
技术实现思路
本专利技术的第一方面，涉及一种人源化基因改造动物模型的构建方法，所述的人源化基因改造动物模型体内表达人或人源化LAG-3蛋白，同时内源LAG-3蛋白的表达降低或缺失。优选的，所述的人源化基因改造动物模型的基因组中至少包括人LAG-3基因的外显子2至外显子4的全部或部分核苷酸序列，所述的人LAG-3基因通过内源LAG-3调控元件调控。进一步优选的，所述的人源化基因改造动物模型的基因组中至少包括人LAG-3基因的外显子2的全部或部分核苷酸序列、外显子3的全部核苷酸序列和/或外显子4的全部或部分核苷酸序列。再进一步优选的，所述的人源化基因改造动物模型的基因组中还包括外显子5至外显子7的全部或部分核苷酸序列。在本专利技术的一个具体实施方式中，所述的人源化基因改造动物模型的基因组中包括外显子2至外显子7的全部或部分核苷酸序列。优选的，所述的人LAG-3基因通过LAG-3调控元件调控。在本专利技术的一个具体实施方式中，所述的人源化基因改造动物模型的基因组中至少包括人LAG-3基因的外显子2的全部或部分核苷酸序列。在本专利技术的一个具体实施方式中，所述的人源化基因改造动物模型的基因组中至少包括人LAG-3基因的外显子3的全部核苷酸序列。在本专利技术的一个具体实施方式中，所述的人源化基因改造动物模型的基因组中至少包括人LAG-3基因的外显子4的全部或部分核苷酸序列。在本专利技术的一个具体实施方式中，所述的人源化基因改造动物模型的基因组中至少包括人LAG-3基因的外显子2-3的全部或部分核苷酸序列。在本专利技术的一个具体实施方式中，所述的人源化基因改造动物模型的基因组中至少包括人LAG-3基因的外显子2、4的全部或部分核苷酸序列。在本专利技术的一个具体实施方式中，所述的人源化基因改造动物模型的基因组中至少包括人LAG-3基因的外显子3、4的全部或部分核苷酸序列。在本专利技术的一个具体实施方式中，所述的人源化基因改造动物模型的基因组中至少包括人LAG-3基因的外显子2-4的全部或部分核苷酸序列。在本专利技术的一个具体实施方式中，所述的人源化基因改造动物模型的基因组中包括人LAG-3基因的外显子2至外显子4的全部或部分核苷酸序列；优选的，所述的人源化基因改造动物模型的基因组中包括内源LAG-3基因的外显子1的全部核苷酸序列、外显子2的部分核苷酸序列、外显子4的部分核苷酸序列和外显子5及其后的全部核苷酸序列。在本专利技术的一个具体实施例中，所述的人源化基因改造动物模型的基因组中包括人LAG-3基因的外显子2的全部或部分核苷酸序列、外显子3至外显子6的全部核苷酸序列和外显子7的全部或部分核苷酸序列。或者，所述的人源化基因改造动物模型的基因组中包括内源LAG-3基因的外显子1的全部核苷酸序列、外显子2的部分核苷酸序列、外显子7的部分核苷酸序列和外显子8的全部核苷酸序列。优选的，所述的人源化基因改造动物模型的基因组中包括人源化LAG-3基因，所述人源化LAG-3基因编码的蛋白包括胞外区、跨膜区以及胞内参与信号传导的区域，其中编码胞内参与信号传导的人源化LAG-3基因的核苷酸序列为动物来源，编码胞外区的人源化LAG-3基因的核苷酸序列的全部或部分为人来源，同时编码该动物来源部分和人来源部分LAG-3蛋白的核苷酸序列通过序列拼接连接于动物来源LAG-3启动子后。优选的，所述人源化LAG-3基因编码的跨膜区部分为人来源。本专利技术所述的人源化基因改造动物模型的构建方法，使用基因编辑技术进行LAG-3人源化动物模型的构建，所述基因编辑技术包括利用胚胎干细胞的DNA打靶技术、CRISPR/Cas9技术、锌指核酸酶技术、转录激活子样效应因子核酸酶技术、归巢核酸内切酶或其他分子生物学技术。在本专利技术的一个具体实施方式中，所述非人动物为小鼠，所述小鼠LAG-3的mRNA序列的全部或部分片段如SEQIDNO：1中的全部或部分片段所示，所述小鼠LAG-3的氨基酸序列的全部或部分片段如SEQIDNO：2中的全部或部分片段所示。在本专利技术的另一个具体实施方式中，所述人LA本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种人源化基因改造动物模型的构建方法，其特征在于，所述的人源化基因改造动物模型体内表达人或人源化LAG-3蛋白，同时内源LAG-3蛋白的表达降低或缺失。/n

【技术特征摘要】
20181220 CN 20181156073351.一种人源化基因改造动物模型的构建方法，其特征在于，所述的人源化基因改造动物模型体内表达人或人源化LAG-3蛋白，同时内源LAG-3蛋白的表达降低或缺失。


2.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述的人源化基因改造动物模型的基因组中至少包括人LAG-3基因的外显子2至外显子4的全部或部分核苷酸序列，所述的人LAG-3基因通过内源LAG-3调控元件调控。


3.根据权利要求1或2所述的构建方法，其特征在于，所述的人源化基因改造动物模型的基因组中包括外显子2至外显子7的全部或部分核苷酸序列。


4.根据权利要求1-3任一所述的构建方法，其特征在于，所述的人源化基因改造动物模型的基因组中包括人源化LAG-3基因，所述人源化LAG-3基因编码的蛋白包括胞外区、跨膜区以及胞内参与信号传导的区域，其中编码胞内参与信号传导的人源化LAG-3基因的核苷酸序列为动物来源，编码胞外区的人源化LAG-3基因的核苷酸序列的全部或部分为人来源，同时编码该动物来源部分和人来源部分LAG-3蛋白的核苷酸序列通过序列拼接连接于动物来源LAG-3启动子后。


5.根据权利要求4所述的构建方法，其特征在于，所述的构建方法包括将编码胞外区的内源LAG-3基因全部或部分核苷酸序列替换为人编码胞外区的LAG-3基因的全部或部分核苷酸序列；其中，所述的人编码胞外区的LAG-3基因的全部或部分核苷酸序列包含人LAG-3基因的外显子2的部分核苷酸序列、外显子3的全部核苷酸序列和外显子4的部分核苷酸序列；优选的，将编码胞外区和跨膜区的内源LAG-3基因全部或部分核苷酸序列替换为人编码胞外区和跨膜区的LAG-3基因的全部或部分核苷酸序列；其中，所述的人编码胞外区和跨膜区的LAG-3基因的全部或部分核苷酸序列包含人LAG-3基因的外显子2的部分核苷酸序列、外显子3的全部核苷酸序列、外显子4的全部核苷酸序列、外显子5的全部核苷酸序列、外显子6的全部核苷酸序列和外显子7的部分核苷酸序列。


6.根据权利要求1-5任一所述的构建方法，其特征在于，使用靶向载体构建人源化基因改造动物模型，所述的靶向载体包含供体DNA序列，其编码供体转换区，所述的供体DNA序列至少包括人LAG-3基因的外显子2的全部或部分核苷酸序列、外显子3的全部核苷酸序列和/或外显子4的全部或部分核苷酸序列；所述的靶向载体将内源LAG-3基因的外显子2的全部或部分核苷酸序列至外显子4的全部或部分核苷酸序列替换为人LAG-3基因的外显子2的全部或部分核苷酸序列、外显子3的全部核苷酸序列和外显子4的全部或部分核苷酸序列；
优选的，所述的供体DNA序列还包含外显子5的全部核苷酸序列、外显子6的全部核苷酸序列和外显子7的全部或部分核苷酸序列；所述的靶向载体将内源LAG-3基因的外显子2的全部或部分核苷酸序列至外显子7的全部或部分核苷酸序列替换为人LAG-3基因的外显子2的全部或部分核苷酸序列、外显子3的全部核苷酸序列、外显子4的全部核苷酸序列、外显子5的全部核苷酸序列、外显子6的全部核苷酸序列和外显子7的全部或部分核苷酸序列。


7.根据权利要求1-6任一所述的构建方法，其特征在于，所述的人源化LAG-3蛋白包括人LAG-3蛋白的部分氨基酸序列和非人动物LAG-3蛋白的部分氨基酸序列，优选的，所述的人LAG-3蛋白的部分氨基酸序列选自下列组中的一种：
a)为SEQIDNO：4第25-258位或第25-465位所示氨基酸序列的部分或全部；
b)与SEQIDNO：4第25-258位或第25-465位所示氨基酸的序列同一性至少为90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％；
c)与SEQIDNO：4第25-258位或第25-465位所示的氨基酸的序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个氨基酸；或，
d)具有SEQIDNO：4第25-258位或第25-465位所示的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个氨基酸残基的氨基酸序列。


8.根据权利要求1-7任一所述的构建方法，其特征在于，所述的人源化LAG-3蛋白的氨基酸序列选自下列组中的一种：
a)为SEQIDNO：9或SEQIDNO：44所示氨基酸序列的部分或全部；
b)与SEQIDNO：9或SEQIDNO：44所示氨基酸的序列同一性至少为90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％；
c)与SEQIDNO：9或SEQIDNO：44所示的氨基酸的序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个氨基酸；或，
d)具有SEQIDNO：9或SEQIDNO：44所示的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个氨基酸残基的氨基酸序列。


9.根据权利要求1-8任一所述的构建方法，其特征在于，所述的人源化基因改造动物模型基因组中包括人源化LAG-3基因，所述的人源化LAG-3基因包含人LAG-3基因的部分核苷酸序列和非人动物LAG-3基因的部分核苷酸序列，优选的，所述的人LAG-3基因的部分核苷酸序列选自下列组中的一种：
a)为SEQIDNO：7或SEQIDNO：42所示核苷酸序列的部分或全部；
b)与SEQIDNO：7或SEQIDNO：42所示的核苷酸序列的部分或全部的同一性至少为90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％；
c)与SEQIDNO：7或SEQIDNO：42所示的序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个核苷酸；
d)具有SEQIDNO：7或SEQIDNO：42所示的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个核苷酸的核苷酸序列；
e)转录的mRNA序列为SEQIDNO：3第422-1123位或第422-1747位所示核苷酸序列的部分或全部；
f)转录的mRNA序列与SEQIDNO：3第422-1123位或第422-1747位所示的核苷酸序列的部分或全部的同一性至少为90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％；
g)转录的mRNA序列与SEQIDNO：3第422-1123位或第422-1747位所示的核苷酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个核苷酸；或
h)转录的mRNA序列具有SEQIDNO：3第422-1123位或第422-1747位所示的核苷酸序列所示的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个核苷酸的核苷酸序列。


10.根据权利要求9所述的构建方法，其特征在于，所述的人源化LAG-3基因编码权利要求7或8所述的人源化LAG-3蛋白，或所述的人源化LAG-3基因的核苷酸序列选自下列组中的一种：
a)转录的mRNA序列为SEQIDNO：8或SEQIDNO：43所示的序列的部分或全部；
b)转录的mRNA序列与SEQIDNO：8或SEQIDNO：43所示的核苷酸序列的部分或全部的同一性至少为90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％；
c)转录的mRNA序列与SEQIDNO：8或SEQIDNO：43所示的核苷酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个核苷酸；
d)转录的mRNA序列具有SEQIDNO：8或SEQIDNO：43所示的核苷酸序列所示的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个核苷酸的核苷酸序列；
e)为包含SEQIDNO：45、SEQIDNO：46、SEQIDNO：67、SEQIDNO：68、SEQIDNO：69、SEQIDNO：70和/或SEQIDNO：71所示序列的全部或部分；
f)与包含SEQIDNO：45、SEQIDNO：46、SEQIDNO：67、SEQIDNO：68、SEQIDNO：69、SEQIDNO：70和/或SEQIDNO：71所示序列的部分或全部的同一性至少为90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％；
g)与包含SEQIDNO：45、SEQIDNO：46、SEQIDNO：67、SEQIDNO：68、SEQIDNO：69、SEQIDNO：70和/或SEQIDNO：71所示的核苷酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个核苷酸；或，
h)具有包含SEQIDNO：45、SEQIDNO：46、SEQIDNO：67、SEQIDNO：68、SEQIDNO：69、SEQIDNO：70和/或SEQIDNO：71所示的核苷酸序列所示的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个核苷酸的核苷酸序列。


11.一种LAG-3基因的靶向载体，其特征在于，所述的靶向载体包含供体DNA序列，其编码供体转换区，所述的供体DNA序列至少包括人LAG-3基因的外显子2的全部或部分核苷酸序列、外显子3的全部核苷酸序列和/或外显子4的全部或部分核苷酸序列；优选的，所述的供体DNA序列包含外显子2的全部或部分核苷酸序列、外显子3的全部核苷酸序列、外显子4的全部核苷酸序列、外显子5的全部核苷酸序列、外显子6的全部核苷酸序列和外显子7的全部或部分核苷酸序列。


12.根据权利要求11所述的靶向载体，其特征在于，所述的靶向载体包含与待改变的转换区5’端同源的DNA片段，即5’臂，其选自与NCBI登录号为NC_000072.6至少具有90％同源性的核苷酸；优选的，所述5’臂的核苷酸序列如SEQIDNO：5所示或所述5’臂的核苷酸序列与NCBI登录号与NC_000072.6的第124914544-124910898位核苷酸序列相同；
和/或，所述的与待改变的转换区3’端同源的第二个DNA片段，即3’臂，其选自NCBI登录号为NC_000072.6至少具有90％同源性的核苷酸；优选的，所述3’臂的核苷酸序列如SEQIDNO：6所示或所述3’臂的核苷酸序列与NCBI登录号与NC_000072.6的第124903953-124907833位核苷酸序列相同。


13.根据权利要求11所述的靶向载体，其特征在于，所述的靶向载体包含与待改变的转换区5’端同源的DNA片段，即5’臂，其选自与NCBI登录号为NC_000072.6至少具有90％同源性的核苷酸；优选的，所述5’臂的核苷酸序列如SEQIDNO：40所示；
和/或，所述的与待改变的转换区3’端同源的第二个DNA片段，即3’臂，其选自NCBI登录号为NC_000072.6至少具有90％同源性的核苷酸；优选的，所述3’臂的核苷酸序列如SEQIDNO：41所示。


14.一种特异的靶向LAG-3基因的sgRNA序列，其特征在于，所述的sgRNA序列在动物LAG-3基因的靶位点位于动物LAG-3基因的外显子2和/或外显子4上；优选的，sgRNA靶向的5’端靶位点核苷酸序列如SEQIDNO：10-16任一项所示，3’端靶位点核苷酸序列如SEQIDNO：17-23任一项所示；更优选的，使用的sgRNA靶位点核苷酸序列为SEQIDNO：14和/或SEQIDNO：17。


15.一种构建人源化基因改造动物模型的载体，所述的载体产生权利要求14所述的sgRNA序列，用于敲除或替换LAG-3基因的外...

【专利技术属性】
技术研发人员：沈月雷，姚佳维，郭朝设，郭雅南，白阳，黄蕤，赵磊，张美玲，
申请(专利权)人：百奥赛图江苏基因生物技术有限公司，北京百奥赛图基因生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏;32