一种人源化细胞因子动物模型、制备方法及应用技术

本发明专利技术涉及一种人源化基因改造非人动物，具体涉及表达人源化IL‑6R和/或IL‑6蛋白的动物模型。在一些例子中，表达人源化IL‑6R和/或IL‑6的经遗传修饰的非人动物还有免疫缺陷表型，和/或含有IL3、GM‑CSF等更多细胞因子人源化。本发明专利技术还提供了上述包含IL‑6R和/或IL‑6基因修饰的人源化非人动物的构建方法及其在生物医药领域的应用。

An animal model, preparation and application of human derived cytokines

【技术实现步骤摘要】
一种人源化细胞因子动物模型、制备方法及应用
本申请涉及人源化基因改造动物模型的建立方法及应用，具体而言，涉及基于一种人源化IL-6R和/或IL-6基因改造动物模型的构建方法及其在生物医药领域的应用。
技术介绍
实验动物疾病模型对于研究人类疾病发生的病因、发病机制、开发防治技术和开发药物是不可缺少的研究工具。但由于动物与人类的生理结构和代谢系统本身的差异，传统的动物模型并不能很好的反映人体的真实状况，在动物体内建立更接近人类的生理特征的疾病模型是生物医药行业的迫切需求。随着基因工程技术的不断发展和成熟，用人类基因替代或置换动物的同源性基因已经实现，通过这种方式开发人源化实验动物模型(humanizedanimalmodel)是动物模型未来的发展方向。其中基因人源化动物模型，即，利用基因编辑技术，用人源正常或突变基因替换动物基因组的同源基因，可建立更接近人类生理或疾病特征的正常或突变基因动物模型。基因人源化动物不但本身具有重要应用价值，如通过基因人源化可改进和提升细胞或组织移植人源化动物模型，更重要的是，由于人类基因片段的插入，动物体内可表达或部分表达人源蛋白，可作为仅能识别人氨基酸序列的药物的靶点，为在动物水平进行抗人抗体及其它药物的筛选提供了可能。然而，由于动物与人类在生理学及病理学方面存在差异，加上基因(即遗传因子)的复杂性，如何能构建出“有效”的人源化动物模型用于新药研发仍是最大的挑战(ScheerN,SnaithM,WolfCR,SeiblerJ.Generationandutilityofgeneticallyhumanizedmousemodels,DrugDiscovToday；18(23-24):1200-11,2013)。细胞的分化、发育、增值乃至活化，均受到多个细胞因子信号的协同作用，其中白介素6(interkeukin6，IL6，IL-6)是一种多效细胞因子，可调节T细胞活化、分化，抑制T细胞凋亡；促进骨髓造血干细胞生长；增强血细胞分化；诱导B细胞分化、产生免疫球蛋白；促进肿瘤细胞生长、增殖和迁移等多种功能。IL-6既可由淋巴细胞(如，T细胞)分泌，也可以由非淋巴细胞分泌(如，成纤维细胞和内皮细胞等)。IL-6的受体是IL-6R，其可以在细胞膜经过蛋白质水解，形成可溶性IL-6R(sIL-6R)，在人类中，也可以在翻译阶段进行剪接mRNA，进而产生sIL-6R。IL-6与IL-6R链或sIL-6R结合后，招募2个gp130并促使gp130二聚化，形成的复合物通过JAK启动下游通路，分别称为经典途径和反式途径。由于IL-6R仅表达在少数细胞表面，而sIL-6R广泛存在血清中，而gp130在体细胞中广泛表达，因此IL-6主要通过反式途径发挥作用。正常人血清中的IL-6浓度相对较低，在疾病环境中会迅速升高，例如，在自身免疫性疾病、感染及肿瘤等情况下会快速诱导和大量表达IL-6。国内外研究表明，IL-6介导的信号通路与多种疾病的发生、发展密切相关，包括乳腺癌、类风湿关节炎、系统性红斑狼疮、Castleman病、克罗恩病、肥胖和糖尿病。鉴于IL-6在各种疾病过程中起重要作用，在治疗领域具有巨大应用价值，目前全球范围内已有3款针对IL-6通路的抗体药物上市，分别是ACTEMRA(tocilizumab，靶向IL-6R，2010年FDA批准，适应症包括类风湿性关节炎、巨细胞动脉炎、细胞因子释放综合征和幼儿及青年特发性关节炎)、SYLVANT(siltuximab，靶向IL-6，2014年FDA批准，用于治疗Castleman病)、KEVZARA(sarilumab，靶向IL-6R，2017年FDA批准，用于治疗成人中度至重度活动性类风湿性关节炎)。此外，还有近10个药物处于临床研究中，Informa数据库显示自2017年至今(2018年10月)，新开展的靶向IL-6/IL-6R信号通路的临床研究超过40项，预计随着研究的不断深入，未来会有更多的机构和生物医药企业参与到针对IL-6/IL-6R通路的药物研发中来。由于啮齿类如小鼠的IL-6蛋白与人IL-6蛋白在氨基酸序列上一致性(Identities)41％左右，IL-6R(Identities)53％，所以，一般情况下识别人IL-6或IL-6R蛋白的抗体，无法识别小鼠IL-6或IL-6R，即在IL-6和IL-6R靶点相关药物研发过程中，无法用普通小鼠来筛选和评价靶向人IL-6和IL-6R药物的药效。另外，在免疫缺陷小鼠如NOD-PrkdcscidIL-2rγnull小鼠中发现，尽管这类小鼠机体免疫功能严重缺陷，对人源细胞和组织几乎没有排斥反应，少量细胞即可成瘤(依赖于细胞系或细胞类型)，同时也没有B淋巴细胞泄漏，是最适合人源细胞或组织移植的工具小鼠，并已广泛用于新的人源化小鼠模型研发，但由于鼠的细胞因子不能很好的作用于人的造血细胞，在移植人造血干细胞后，人源细胞的发育和功能上存有缺陷(WatanabeYetal.,IntImmunol.2009Jul；21(7):843-58)。鉴于IL-6和IL-6R在治疗领域具有巨大应用价值，且可以辅助改善在免疫缺陷小鼠体内移植人造血干细胞后人源免疫细胞的发育和功能完善，改进现有动物模型的不足，使临床前期的试验更有效，本领域急需开发新的动物模型。
技术实现思路
本专利技术的第一方面，涉及一种包含IL-6R基因修饰的人源化非人动物的构建方法，所述的人源化非人动物的基因组中包括人IL-6R基因的全部或部分核苷酸序列；该人源化非人动物体内表达人或人源化IL-6R蛋白。优选的，所述的内源IL-6R蛋白表达降低或缺失。本专利技术的第二方面，涉及一种包含IL-6基因修饰的人源化非人动物的构建方法，所述的人源化非人动物的基因组中包括人IL-6基因的全部或部分核苷酸序列，该人源化非人动物表达人或人源化IL-6蛋白。优选的，所述的内源IL-6蛋白表达降低或缺失。本专利技术的第三方面，涉及一种包含IL-6R和IL-6基因修饰的人源化非人动物的构建方法，所述的人源化非人动物的基因组中包括人IL-6R和IL-6基因，该人源化非人动物体内表达人或人源化IL-6R和IL-6蛋白。优选的，所述的内源IL-6R和IL-6蛋白表达降低或缺失。优选的，所述的人IL-6R或IL-6基因通过内源性或外源性调控元件调控。本专利技术使用基因编辑技术进行人源化非人动物的构建，所述基因编辑技术包括利用胚胎干细胞的基因打靶技术、CRISPR/Cas9技术、锌指核酸酶技术、转录激活子样效应因子核酸酶技术、归巢核酸内切酶或其他分子生物学技术。优选的，所述的人源化非人动物的基因组中包括人IL-6R基因的外显子1至外显子10的部分或全部编码序列，所述的人IL-6R基因通过内源性调控元件调控；该人源化非人动物体内表达人或人源化IL-6R蛋白。进一步优选的，所述的外显子1至外显子10的部分为至少30、60、90个与人IL6R基因的核苷酸序列相同，且人源化非人动物体内产生的IL6R蛋白可以结合靶向人特定抗原的抗体。进一步优选的，本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种包含IL-6R基因修饰的人源化非人动物的构建方法，其特征在于，所述的人源化非人动物的基因组中包括人IL-6R基因的全部或部分核苷酸序列；该人源化非人动物体内表达人或人源化IL-6R蛋白。/n

【技术特征摘要】
1.一种包含IL-6R基因修饰的人源化非人动物的构建方法，其特征在于，所述的人源化非人动物的基因组中包括人IL-6R基因的全部或部分核苷酸序列；该人源化非人动物体内表达人或人源化IL-6R蛋白。


2.一种包含IL-6基因修饰的人源化非人动物的构建方法，其特征在于，所述的人源化非人动物的基因组中包括人IL-6基因的全部或部分核苷酸序列，该人源化非人动物表达人或人源化IL-6蛋白。


3.一种包含IL-6R和IL-6基因修饰的人源化非人动物的构建方法，其特征在于，所述的人源化非人动物的基因组中包括人IL-6R和IL-6基因的全部或部分核苷酸序列；该人源化非人动物体内表达人或人源化IL-6R和IL-6蛋白。


4.根据权利要求1或3所述的构建方法，其特征在于，所述的人源化非人动物的基因组中包括人IL-6R基因的外显子1至外显子10的部分或全部编码序列，所述的人IL-6R基因通过内源性调控元件调控。


5.根据权利要求2-4任一所述的构建方法，其特征在于，所述的人源化非人动物的基因组中包括人IL-6基因的至少从外显子1的起始密码子至外显子5的终止密码子的部分或全部核苷酸序列，所述的人IL-6基因长度至少4.7kb，其中，所述的人IL-6基因通过内源性调控元件调控；优选的，所述的人IL-6基因长度至少12.7kb，其中，所述的人IL-6基因通过人源的调控元件调控。


6.根据权利要求1，3-5任一所述的构建方法，其特征在于，所述的构建方法包括将人IL-6R基因的全部或部分核苷酸序列插入非人动物IL-6R基因座，或者将人IL-6R基因的全部或部分核苷酸序列替换非人动物IL-6R基因的相应区域，使得该非人动物表达人IL-6R蛋白；优选的，所述的构建方法包括将编码人IL-6R蛋白的核苷酸序列插入非人动物IL-6R基因的起始密码子后，并使内源性IL-6R基因不表达或表达降低；进一步优选的，所述的构建方法包括将编码人IL-6R蛋白的核苷酸序列插入非人动物IL-6R基因的外显子1，其中，插入的编码人IL-6R蛋白的核苷酸序列后还包括辅助序列，所述的辅助序列为WPRE和/或polyA。


7.根据权利要求1，3-6任一所述的构建方法，其特征在于，所述的构建方法包括使用靶向载体将编码人IL-6R蛋白的核苷酸序列和辅助序列的连接序列插入非人动物IL-6R基因的外显子1；所述的靶向载体包含插入的供体DNA序列，其编码供体转换区，所述的插入的供体DNA序列包含人IL-6R基因的全部或部分核苷酸序列。


8.根据权利要求1，3-7任一所述的构建方法，其特征在于，所述的人源化非人动物的基因组中包括嵌合IL-6R基因，所述的嵌合IL-6R基因编码人IL-6R蛋白，所述的嵌合IL-6R基因的核苷酸序列选自：
a)与SEQIDNO：65所示的核苷酸序列的同一性至少为90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％；
b)来源于人IL-6R基因的部分与SEQIDNO：65第1-1407位所示的核苷酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个核苷酸；
c)来源于人IL-6R基因的部分具有SEQIDNO：65第1-1407位所示的核苷酸序列所示的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个核苷酸的核苷酸序列；
d)来源于人IL-6R基因的部分为与SEQIDNO：61所示的核苷酸序列同一性至少为90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％；
e)来源于人IL-6R基因的部分为与SEQIDNO：61第438-1844位所示的序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个核苷酸；或
f)来源于人IL-6R基因的部分为具有SEQIDNO：61第438-1844位所示的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个核苷酸的核苷酸序列。


9.根据权利要求2-8任一所述的构建方法，其特征在于，所述的构建方法包括将人IL-6基因的全部或部分核苷酸序列插入非人动物IL-6基因座，或者将人IL-6基因的全部或部分核苷酸序列替换非人动物IL-6基因的相应区域，使得该非人动物表达人IL-6蛋白；优选的，所述的构建方法包括将人IL-6基因的至少从外显子1的起始密码子至外显子5的终止密码子的部分或全部核苷酸序列替换非人动物IL-6基因的相应区域。


10.根据权利要求2-9任一所述的构建方法，其特征在于，所述的构建方法包括利用基因编辑技术，使用靶向载体将人IL-6基因的至少从外显子1的起始密码子至外显子5的终止密码子的部分或全部核苷酸序列替换非人动物IL-6基因的相应区域；所述的靶向载体包含替换的供体DNA序列，其编码供体转换区，所述的替换的供体DNA序列包含人IL-6基因的至少从外显子1的起始密码子至外显子5的终止密码子的部分或全部序列。


11.根据权利要求2-10任一所述的构建方法，其特征在于，所述的构建方法包括基于CRISPR/Cas9技术，使用sgRNA靶向序列将人IL-6基因的至少从外显子1的起始密码子至外显子5的终止密码子的部分或全部核苷酸序列替换非人动物IL-6基因的相应区域；
所述的sgRNA靶向的5’端靶位点序列如SEQIDNO：22-28任一项所示，3’端靶位点序列如SEQIDNO：29-36任一项所示；更优选的，使用的sgRNA靶位点序列为SEQIDNO：26和/或SEQIDNO：34。


12.根据权利要求2-11任一所述的构建方法，其特征在于，所述的人源化非人动物的基因组中包含嵌合IL-6基因，所述的嵌合IL-6基因编码人IL-6蛋白，所述的嵌合IL-6基因的核苷酸序列选自：
a)转录的mRNA序列与SEQIDNO：49或SEQIDNO：50所示的核苷酸序列的同一性至少为90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％；
b)转录的mRNA序列与SEQIDNO：49或SEQIDNO：50所示的核苷酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个核苷酸；
c)转录的mRNA序列具有SEQIDNO：49或SEQIDNO：50所示的核苷酸序列所示的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个核苷酸的核苷酸序列；
d)来源于人IL-6基因的部分为与SEQIDNO：5或SEQIDNO：7或SEQIDNO：11或SEQIDNO：48所示的核苷酸序列同一性至少为90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％；
e)来源于人IL-6基因的部分为与SEQIDNO：5或SEQIDNO：7或SEQIDNO：11或SEQIDNO：48所示的序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个核苷酸；或
f)来源于人IL-6基因的部分为具有SEQIDNO：5或SEQIDNO：7或SEQIDNO：11或SEQIDNO：48所示的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个核苷酸的核苷酸序列。


13.一种IL-6R基因的靶向载体，其特征在于，所述的靶向载体包含插入的供体DNA序列，其编码供体转换区，所述的插入的供体DNA序列包含人IL-6R基因的全部或部分核苷酸序列。


14.根据权利要求13所述的靶向载体，其特征在于，所述的靶向载体包含与待改变的转换区5’端同源的DNA片段，即5’臂，其选自与NCBI登录号为NC_000069.6至少具有90％同源性的核苷酸；优选的，所述5’臂核苷酸序列如SEQIDNO：63所示；
或者，所述的靶向载体包含与待改变的转换区3’端同源的第二个DNA片段，即3’臂，其选自NCBI登录号为NC_000069.6至少具有90％同源性的核苷酸；优选的，所述3’臂核苷酸序列如SEQIDNO：64所示；
或者，所述的插入的供体DNA序列如SEQIDNO：65所示。


15.根据权利要求14所述的靶向载体，其特征在于，所述的待改变的转换区位于Il-6R基因的外显子1至外显子10。


16.一种IL-6基因的靶向载体，其特征在于，所述的靶向载体包含替换的供体DNA序列，其编码供体转换区，所述的替换的供体DNA序列包含人IL-6基因的全部或部分核苷酸序列。


17.根据权利要求16所述的靶向载体，其特征在于，所述的靶向载体包含与待改变的转换区5’端同源的DNA片段，即5’臂，其选自与NCBI登录号为NC_000071.6至少具有90％同源性的核苷酸；优选的，所述5’臂核苷酸序列如SEQIDNO：9所示；
或者，所述的靶向载体包含与待改变的转换区3’端同源的第二个DNA片段，即3’臂，其选自NCBI登录号为NC_000071.6至少具有90％同源性的核苷酸；优选的，所述3’臂核苷酸序列如SEQIDNO：10所示；
或者，所述的插入的供体DNA序列如SEQIDNO：11所示。


18.根据权利要求16所述的靶向载体，其特征在于，所述的靶向载体包含与待改变的转换区5’端同源的DNA片段，即5’臂，其选自与NCBI登录号为NC_000071.6至少具有90％同源性的核苷酸；优选的，所述5’臂核苷酸序列如SEQIDNO：46所示；
或者，所述的靶...

【专利技术属性】
技术研发人员：沈月雷，张美玲，姚佳维，郭朝设，郭雅南，白阳，黄蕤，赵磊，尚诚彰，
申请(专利权)人：百奥赛图江苏基因生物技术有限公司，北京百奥赛图基因生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏;32